RNA干扰Grp78蛋白对肺癌细胞A549的作用研究(2)
| 第1页 |
参见附件。
1.4.3 免疫荧光检测 RNA干扰后的细胞，加入0.25%胰蛋白酶，消化2 min，以1×105/ml的密度接种于10 μg/ml L-多聚赖氨酸预包被的盖玻片上，继续培养24 h，待细胞充分伸展后取出盖玻片，PBS漂洗，3.7% 甲醛固定30 min，0.2% Triton-X-100透化5 min,1% BSA封闭30 min，一抗(anti-Grp78)室温温育1 h，PBS漂洗，加入二抗(FITC标记的羊抗兔IgG)，室温避光，37 ℃孵育1 h，95%甘油封片，荧光显微镜下观察细胞的Grp78蛋白表达并随机选取10个视野进行计数，记录每个视野细胞的阳性表达率。
1.4.4 免疫印迹实验 RNA干扰的方法如前所述，最后一次转染后继续培养72 h，将细胞样品用TBS漂洗后加入RIPA缓冲液(1% NP-40、0.5% 脱氧胆酸钠、1% SDS、0.1% PMSF)裂解细胞，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。加热变性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入1∶1000倍稀释的一抗(Grp78, MMP-2, MMP-9)杂交2 h，TBST洗膜后加入二抗温育1 h，TBST洗膜后进行BCIP/NBT显色，采用Chemi-genius凝胶成像系统分析Grp78，MMP-2，MMP-9蛋白的表达量。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件对数据进行单因素方差分析和卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 siRNA干扰对A549细胞的Grp78蛋白的影响 siRNA转染肺癌细胞A549并进行表达，随着转染后时间的延长，Grp78蛋白表达呈时间依赖性减少(见图1A，1B)。免疫印迹(Western-blot)实验结果(见图1C)显示，Grp78蛋白量随着siRNA干扰后逐渐减少。
2.2 SiRNA干扰Grp78蛋白对细胞黏附的影响 为了研究通过siRNA干扰特异性地下调Grp78蛋白对肺癌细胞A549黏附特性的影响，笔者应用细胞黏附实验对细胞与细胞外基质的黏附能力进行了研究 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件。