Chk1反义寡核苷酸影响胶质瘤放疗敏感性的研究(2)
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参见附件。
1.2.3 Western Blot检测Chk1蛋白 取上述各组收集的U251细胞，提取总蛋白。电泳前将样品与缓冲液混合后煮沸5 min，作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭1 h，鼠抗人一抗Chk1及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗37 ℃各孵育1 h，最后用化学发光底物进行发光显迹。
1.2.4 实时定量PCR法(Real-Time PCR)检测Chk1 mRNA表达 对上述各组处理的细胞提取总量RNA，并测定RNA的含量。以RNA为模板逆转录成cDNA，进行PCR反应，以β-actin为内参照。根据Genbank Database 中Chk1基因的mRNA序列，应用Primer Express 2.0设计软件针对Chk1和内参β-actin设计引物和Taqman探针序列。Real Time PCR反应条件如下：预变性：95 ℃ 10 s；循环：95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s，共40循环。结果采用Rotor gene 3000型实时荧光定量PCR仪自带程序用双标准曲线法分析Ct(Cycle threshold)值。Chk1及β-actin的PCR引物序列见表1。
1.2.5 检测细胞凋亡及细胞周期 细胞经上述各组处理后，观察各组细胞漂浮情况，在细胞周期阻滞最显著时间前后收获各组肿瘤细胞，严格按照AnnexinV/FITC-PI凋亡检测试剂盒上的说明操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，采取t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 反义封闭Chk1基因对Chk1 mRNA及蛋白表达的影响 实时定量PCR检测发现与空白对照组相比，反义封闭Chk1基因对Chk1在mRNA水平有下调作用，下调率为空白对照组的11%(见图1)，差异有统计学意义(P<0.01)。实验中Western Blot(见图2)与Real-Time PCR检测结果一致，转染Chk1反义寡核苷酸24 h可明显抑制Chk1蛋白表达，下调率为空白对照组的8%(见图3)，差异有统计学意义(P<0.01)，而β-actin蛋白表达无明显变化。实验中发现，转染Chk1正义寡核苷酸无论对Chk1 mRNA还是对蛋白表达水平均无明显影响(P>0.05)。
图1 Real-Time PCR检测转染后Chk1 mRNA相对转录水平
图2 Western Blot检测转染后Chk1蛋白产物
图3 Western Blot检测转染后Chk1蛋白相对表达水平
2.2 反义封闭Chk1基因对放疗作用下细胞周期和凋亡的影响 细胞株经各组处理后，镜下观察细胞漂浮情况，发现转染反义寡核苷酸组较转染正义寡核苷酸组和未处理组的漂浮细胞明显增多，而转染正义寡核苷酸组和未处理组漂浮细胞无明显差别。收获各组肿瘤细胞进行Annexin V染色后检测细胞凋亡情况，发现转染Chk1反义寡核苷酸后放射线诱导的Annexin V凋亡率为(35.25±3.75)%，明显高于转染Chk1正义寡核苷酸组的(14.90±1.80)%，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。
U251细胞未处理组G2/M期细胞占(20.76±1.75)%，放疗后出现G2/M期阻滞占(76.35±3.46)%，经放射处理后，细胞被阻滞在G2/M期。转染Chk1反义寡核苷酸组的细胞凋亡率为(16.16±2.89)%，明显高于转染Chk1正义寡核苷酸组(9.70±0.76)%(P<0.01)，检测发现在G2/M期细胞比例上，转染Chk1反义寡核苷酸组(38.96±1.34)%较转染Chk1正义寡核苷酸组(54.85±2.84)%明显降低(P<0.01)。见表2。
3 讨论
细胞周期检测点激酶Chk1是DNA损伤修复通路中最重要的蛋白激酶，主要参与G2/M期细胞周期检测点信号传导通路的调控[3]。目前已有大量研究证实Chk1与人白血病细胞、乳腺癌MCF-7细胞、HeLa细胞、头颈鳞癌A253细胞的放、化疗敏感性密切相关[5-8]，然而Chk1与胶质瘤放疗敏感性的关系尚未见大量报道。本研究发现，接受射线照射后U251胶质瘤细胞主要表现为G2/M期阻滞。照射后肿瘤细胞产生的G2/M期阻滞与其DNA损伤修复有关，G2/M期阻滞为照射后受损伤的肿瘤细胞修复创造条件，而肿瘤细胞的损伤修复降低了放射线对肿瘤细胞的杀灭效应，从而导致放疗抵抗。
反义脱氧寡核苷酸(AsODN)是一种人工合成的单链DNA片段，根据碱基互补配对原理，能与特定的靶mRNA互补结合，选择性地封闭特定的靶基因，高度特异性的抑制靶基因的翻译与表达[9]。本实验合成的Chk1反义寡核苷酸，以全程硫代修饰增加反义寡核苷酸的稳定性，防止其在细胞外被RNA酶降解，并以脂质体法优化细胞的转染条件，提高其转染效率。Real-Time PCR检测发现，Chk1反义寡核苷酸对Chk1在mRNA水平有明显下调作用，Western Blot检测结果与此相一致，转染Chk1反义寡核苷酸后同样可明显抑制Chk1蛋白的表达，以上结果表明，特异性灭活Chk1基因可显著增敏放射线诱导的U251肿瘤细胞凋亡。
本课题在特异性灭活Chk1基因对放疗作用的U251肿瘤细胞周期影响的研究中发现，Chk1反义寡核苷酸选择性封闭Chk1基因表达后，放射线诱导的肿瘤细胞G2/M期阻滞消失，细胞分裂周期被重新启动，同时细胞凋亡率显著增强，这进一步证明了选择性反义封闭Chk1基因能明显增加肿瘤细胞对放射线的敏感性。有研究发现，用Chk1抑制剂UCN-01处理U87胶质瘤细胞株后能阻断TMZ诱导的Chk1基因的短暂表达增强和肿瘤细胞的G2/M期阻滞，从而增加肿瘤细胞的凋亡[10]，这说明选择性抑制Chk1基因能增加U87细胞对化疗药物的敏感性 ......
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