SELDI技术预测FOLFIRI方案治疗结肠癌疗效敏感性的应用研究(2)
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参见附件。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2009年3-9月山西省肿瘤医院收治的晚期结肠癌术后患者12例，其中男6例，女6例，年龄43~78岁，平均57岁。所有患者均经病理诊断为腺癌，其中肺转移1例，肝转移1例，乳腺转移1例。
1.2 入组标准 经组织病理学或细胞学确诊的结肠癌术后患者；血常规及生化检查基本正常；无重要脏器功能衰竭；所有患者接受化疗前Karnofsky评分均在70分以上；至少有一个可测量病灶和(或)可评价的肿瘤标志物；患者的预计生存期≥3个月。
1.3 治疗方法 所有患者均采用FOLFIRI方案化疗，用法：伊立替康CPT-11(国产)120~150 mg/m2静脉滴注第1天；CF 200 mg/m2静脉滴注第1~2天；5-Fu 400 mg/m2静脉推注第1~2天；5-Fu 1000 mg/m2泵控持续静脉滴注44 h。14 d为1周期。化疗3周期后，对有可测量病灶或可评价肿瘤标志物的患者进行疗效评价，如有毒副作用不能耐受者出组。针对可观察的肿瘤每周期化疗前后行影像学检查，服药前及服药后一个月开始常规血液检查。
1.4 实验工作
1.4.1 标本采集 于首次治疗前，清晨空腹时采集末梢静脉血3 ml(不抗凝)，静置，离心5 min(离心半径3000 r/m)，分离出血清，-80 ℃低温冰箱保存(备用)。
1.4.2 主要仪器、试剂及软件 PBS-Ⅱc表面增强飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)(Ciphergen Biosystems，Inc.美国)、能量吸收分子EMA(Ciphergen Biosystems，Inc.美国)，CM 10型蛋白质芯片(Ciphergen Biosystems，Inc.美国)及相应分析软件ProteinChip 3.2.0、Biomarker Wizard 3.1 (美国Ciphergen公司)，HFPFS缓冲盐(Sigma公司)，CHAPS缓冲盐(Sigma公司)。
1.4.3 实验方法 (1)血清样本处理：将血清标本冰浴解冻，10 000 r/min离心2 min。取血清样品5 μl ，加入10 μl 9 M尿素，振荡30 min，加180 μl缓冲液稀释(100 mmol/L NaOAc pH 4.0)，4 ℃条件下10 000 r/min离心2 min，取上清待用。(2)芯片处理：把芯片放入盛有100 mmol/L盐酸的试管中，振荡4~5 min，HPLC水冲洗。将芯片安装到Bioprocessor上，每孔加入200 μl结合缓冲液，室温振荡5 min，弃掉液体再重复一次，每孔上样100 μl处理好的血清样品，室温振荡1 h。弃掉液体，用200 μl结合缓冲液(100 mmol/L NaOAc pH 4.0)洗2次，每次5 min，拆下芯片，待芯片自然干燥后，每点加SPA 0.5 μl，两次，干燥，用CM 10蛋白芯片阅读仪读芯片。[SPA=Sinapinic acid为TFA(三氟乙酸)0.5%和CAN(乙腈)50%的饱和溶液](3)数据收集：设定检样激光强度195，检测灵敏度8，收集数据的质荷比(M/Z)范围1.0~2.0 KD，收集位置20~80，平均每点收集20次，收集总点数为140次。每次实验数据收集前，都用All-in-one蛋白芯片校正仪器校正，使误差小于0.1%。以质量控制蛋白质芯片做重复性检测，其峰值的大小及其强度的变异系数(CVS)均要控制在0.05%和15%以下，具有良好的重复性。
1.5 分析方法
1.5.1 分组方法 根据RECIST(response evaluation criteria in solid tumors)实体瘤近期疗效评价标准，用药3周期后评价疗效，根据疗效评价结果，将研究对象分成稳定组(SD)和无效组(PD)，每组6例。
1.5.2 实验结果的统计学处理 应用ProteinChip 3.2.0、Biomarker Wizard 3.1软件分析不同疗效组间所表达的血清蛋白质指纹图谱数据，寻找各组之间有差异的蛋白质峰，比较两组中相同质荷比的蛋白质含量(丰度)的P值，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 分组实验结果
2.1.1 用SELDI技术获得的12例结肠癌患者的蛋白质组指纹，见图1。
(a) 1372 1698 1865
(b) 1372 1698 1865
图1 12例结肠癌患者的蛋白质质谱图
注：横坐标为M/Z(相对分子量)，纵坐标为蛋白质的相对丰度，(a)为质谱图、(b)为模拟电泳图
2.1.2 应用Biomarker Wizard软件对术后稳定组和无效组血清特异性蛋白质质谱图比较，在检测出的蛋白质峰中，有3个差异蛋白质峰有统计学意义(P<0.05)，见表1，基线漂移(drift)±50H+。
可以看到术后稳定组与无效组相比有3个蛋白质峰有显著差异性，M/Z分别为1372、1698、1865。其中与稳定组相比，无效组上调的峰M/Z为1372和1698，下调的峰M/Z为1865。
2.1.3 稳定组与无效组的差异蛋白质指纹放大图(图2)。
图2 稳定组与无效组的差异蛋白质指纹放大图
注：横坐标为M/Z(相对分子量)，纵坐标为蛋白质的相对丰度
3 讨论
随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，结肠癌的发病率有不断上升的趋势。近年来尽管在诊断、治疗方面有了长足的进展，但结肠癌的总体疗效并无明显改善，手术后5年生存率仍徘徊在50%左右。在结肠癌根治术后的复发转移监测上，约70%的复发转移发生在术后2年内[3-4]，发现肿瘤复发转移时已失去了最佳治疗时机。
肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性是化疗失败的重要原因。多药耐药是指一种药物作用于肿瘤细胞使之产生耐药性后，该肿瘤细胞逐渐对未接触过的、结构无关、作用靶点和机制不同的多种抗肿瘤药物也产生交叉耐药性[5]。如果能在一开始治疗就选择对患者敏感的化疗方案，抓住最佳治疗时机，将有效提高患者生存率及生存质量。目前医学研究认为，耐药的发生与机体的某种蛋白质存在与否及其含量有决定性的关系[6]。蛋白质是基因表达的产物，肿瘤性疾病从蛋白质的角度看，是一种蛋白质缺陷病 ......
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