CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在成人过敏性哮喘急性发作期和缓解期外周血中的表达(1)
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【摘要】目的：探讨成人过敏性哮喘急性发作期和缓解期外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞的表达情况及与病情的相关性。方法：收集健康人、过敏性哮喘急性发作期和缓解期患者外周血，流式细胞术测定CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg的比例。结果：CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞在三组间的差异有统计学意义。哮喘缓解期组、哮喘急性期组较健康对照组该细胞比例均明显下降，哮喘急性期组较哮喘缓解期组更低。CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞数量与哮喘病情严重程度呈负相关。结论：CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞可能在过敏性哮喘的发病过程中起重要作用，它的降低导致的免疫缺陷可能与哮喘的发生相关。
【关键词】成人；过敏性哮喘；调节性T细胞
支气管哮喘是以气道高反应性和气道慢性炎症为特征的变态反应性疾病。Th1/Th2失衡理论在哮喘发病机制中一直占据核心地位[1]。但越来越多的研究[2-4]表明，T细胞亚群，尤其是具有负向调节功能的CD4+ CD25+ Foxp3+T细胞与哮喘发病密切相关。调节性T细胞(regulatory T cell， Treg)为一群表型和功能特异的T细胞，在抑制初始T细胞的活化与增殖、介导免疫耐受方面发挥着重要作用。本研究旨在通过检测不同发病阶段哮喘患者外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞的比例，探讨该细胞水平与哮喘患者病情的关系。
1资料与方法
1.1一般资料2010年1月-2011年5月在笔者所在医院呼吸内科住院患者中筛选出对尘螨过敏的哮喘急性发作期患者。在本院职工中招募志愿者，筛选无症状的尘螨过敏者和无过敏的健康志愿者。研究对象分为三组：(1)尘螨过敏的急性发作期组(24例)，其中男11例，女13例，年龄(35.21±11.39)岁。选择标准如下：符合GINA的诊断标准，在常见的过敏原中，仅对尘螨过敏，且5年内未接受免疫治疗，3个月内未使用口服激素或茶碱制剂，2周未接触吸入激素治疗[5]。(2)无症状的过敏组(23例)，其中男11例，女12例，年龄(36.84±12.39)岁。无过敏症状，仅对尘螨过敏，且体格检查及实验室检查均未发现其他异常。(3)无过敏的健康人组(19例)，其中男10例，女性9例，年龄(34.91±10.27)岁。无过敏症状，对过敏原皮试阴性，体格检查及实验室检查未发现异常。所有研究对象近4周均未患过感染性疾病，无特殊病史。三组患者的性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。该研究符合笔者所在城市医疗卫生行业关于人类研究的相关伦理学要求。所有研究对象均签署书面的知情同意书。
1.2仪器与试剂过敏原皮试液采用Soluprick试剂(ALK， Horsholm， Denmark)；血清过敏原特异性IgE采用Phadebas RAST试剂(Pharmacia， Milton Keynes， UK)；人淋巴细胞分离液(上海华精)；抗CD4-FITC、抗CD25-PE和抗Foxp3-PE-Cy5抗体及同型对照抗体，Foxp3固定破膜剂，PMA、离子霉素和莫能霉素(eBioscience， USA)；FACS Calibur流式细胞仪及分析软件(Becton Dickinson， USA)。
1.3过敏原皮内试验及过敏状态的判定所有研究对象均在笔者所在医院呼吸内科门诊进行过敏原皮内试验。检测项目包括蟑螂、尘螨、混合草花粉等常见吸入性变应原，受检者进行右上臂外侧皮内试验，变应原溶剂作为阴性对照。皮内注射15 min后观察结果：皮丘不增大，周围无红晕者为阴性；红斑直径较阴性对照增大4 mm以上为强阳性。血清中相应特异性IgE通过放射性过敏原吸附试验检测。受检者无过敏症状，过敏原皮试均为阴性，血清过敏原特异性IgE均阴性(<0.34 IU/L)判定为不过敏。
1.4人外周血单个核细胞(PBMC)的制备及体外培养抽取外周静脉血5 ml，与肝素钠充分混匀，加入等量PBS溶液，稀释后备用；将稀释后的血液缓慢加到5 ml淋巴细胞分离液的表面，4 ℃ 2000 r/min离心30 min，吸取白膜层即为外周血PMBC。PBS溶液洗涤后，取1×106的PBMC于6孔细胞培养板中，3 ml RPMI 1640培养液(10%胎牛血清，25 ng/ml PMA，1 μg/ml离子霉素，1.7 μg/ml莫能霉素)，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养4 h后收集，PBS洗涤后置BD流式管中待用。
1.5流式细胞术检测及结果分析细胞分别加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE抗体各1 μL，4 ℃避光孵育30 min，Foxp3固定破膜剂进行固定和破膜处理后，加入抗Foxp3-PE-Cy5抗体2 μL，室温避光孵育30 min。同时做同型对照。标记好的样本1 h内流式细胞仪检测。
1.6统计学处理流式细胞仪检测时采用Cell Quest软件包，并进行数据分析。使用SPSS 11.0软件进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析。如各组均数不全相同，进一步采用SNK法进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1流式细胞术检测外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞结果见图1。
图1流式细胞术分析人外周血单个核细胞中CD4+ CD25+ Foxp3+
T细胞占CD4+ T细胞比例
注：a以同型对照染色样本为阴性对照；b-c以CD4+、CD25+ T细胞设门，分析双阳性细胞中CD4+ Foxp3+ 细胞占CD4+细胞的比例
2.2急性发作组、无症状缓解组、健康对照组外周血CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞占CD4+ T细胞的百分比分别为(3.75±0.83)%、(4.69±0.59)%、(6.19±0.64)%，三组两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
3讨论
初始CD4+ T细胞在不同细胞因子作用下分化为Th1、Th2及Th17等细胞亚型[6]。从上世纪八十年代开始，Th1与Th2之间的比例失衡及Th2细胞优势免疫模式在过敏性哮喘的发病机制中一直占主导地位[7]。1986年Mukherji B等[8]首次报道了在黑素瘤患者的淋巴结中发现了一类具有抑制抗肿瘤免疫反应的T细胞亚群。2005年，随着此类T细胞转录因子Foxp3的确认，该细胞的调节功能被研究人员广泛认可。Foxp3调控天然和适应性CD4+ CD25+ Treg的产生和功能，被认为是活化的CD4+ CD25+ Treg的重要标志物。主要通过细胞与细胞之间的直接接触抑制效应T淋巴细胞活化、增殖及杀伤毒性作用，从而抑制机体免疫反应。CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞的数量、功能的异常会导致各种严重超敏反应和自身免疫反应。
本研究结果显示，与健康对照组相比，哮喘急性期、缓解期患者外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞比例下降，而哮喘急性期组患者较哮喘缓解期组患者更低，说明哮喘患者特别是急性期患者Foxp3的表达水平低下，Treg的负向调节功能受损，对效应T细胞抑制作用不足，可能是哮喘发病的重要原因之一。本实验还发现，约70%的CD4+ CD25+ Treg细胞为CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞，提示当该转录因子开启时，该类细胞才能发挥负向调节作用。, 百拇医药(陈敏 樊黎 吴晓立)