原花青素对过氧化氢损伤血管内皮细胞的保护作用(1)
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【摘要】 目的:探讨原花青素对氧化损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用。方法:体外培养内皮细胞,将细胞分为6组,即空白对照组(Control 组)、氧化损伤组(H2O2组)、氧化损伤加入VitC对照组(VC+H2O2组)、氧化损伤加入原花青素5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L浓度组(procyanidin-L+H2O2组、procyanidin-M+H2O2组、procyanidin-H+H2O2组)。将750 μmol/L H2O2作用于加入VitC及不同浓度原花青素预培养24 h的内皮细胞,继续培养18 h,以细胞毒四唑盐(MTT)比色试验、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)作为检测指标。结果:原花青素呈剂量依赖性降低H2O2对内皮细胞的生长抑制率,降低MDA、LDH量,增加培养液中NO2-/NO3-含量 ,各指标比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:原花青素可保护和修复过氧化氢诱导的血管内皮细胞的损伤,其作用可能与抗氧化、促进NO释放有关。
【关键词】 原花青素; H2O2; 内皮细胞; 氧化损伤; 动脉粥样硬化
细胞凋亡是由基因调控的一种细胞自主有序的死亡方式。细胞数量的稳定取决于细胞凋亡与增殖的动态平衡[1]。目前多项研究证实在动脉粥样硬化等心血管疾病发生发展过程的早期,内皮细胞凋亡有其重要的作用[2]。内皮细胞(EC)凋亡的主要诱导因素就是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的作用[3-5]。而针对这一诱导因素,抗氧化治疗对内皮细胞的凋亡具有保护作用[6-7],因而寻找和开发可以减轻氧化应激对内皮细胞的损害,抑制EC凋亡或死亡的药物对于临床应用有着重要意义。
原花青素(proanthocyanidin或procyanidin,PC)是在植物中广泛存在的具有抗氧化作用的多酚化合物的总称,属于生物类黄酮大家族中的一员,具有清除氧自由基、防止细胞老化、抗肿瘤、对抗血小板活化因子、改善微循环、调节免疫等多种作用。原花青素能否保护氧化损伤HUVEC,国内外相关相关报道不多。本实验研究采用体外培养VEC的方法,采用过氧化氢导致其氧化损伤的模型,研究原花青素对HUVEC损伤过程中过氧化脂质、一氧化氮的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料 原花青素(procyanidin)(南京替斯艾么中药研究所)溶于DMSO(上海生物工程有限公司)后避光保存,1640培养基、胰蛋白酶(杭州科易生物有限公司),VitC(湖北天圣康迪制药有限公司),四氮唑兰 (MTT) (AMRESCO公司),胎牛血清(Hyclone公司),MDA、NO、LDH试剂盒(南京建成生物工程公司),H2O2(30%,AR级,国药集团化学试剂有限公司),临用时稀释,并在5 min内使用。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 HUVEC株系(浙江省中医院中医基础中心实验室馈赠),培养于含10%胎牛血清培养液中,青霉素(Pennicillin)(100 kU/L)和链霉素(streptomycin) (100kU/L),置于37 ℃,5%CO2培养箱中,单层融合达到80%~90%时用0.25%胰酶消化、传代培养,用于以下实验。
1.2.2 细胞分组及处理 待细胞长至60%~70%融合,进行以下分组及实验:空白对照组(Control组)、H2O2损伤组、H2O2损伤加入VitC对照组(VC+H2O2组)、H2O2损伤加入原花青素5 μmol/L、25 μmol/L、50μmol/L浓度组(procyanidin-L+H2O2组、procyanidin-M+H2O2组、procyanidin-H+H2O2组)。H2O2损伤组加入750 μmol/L H2O2刺激18 h,给药组在H2O2刺激前,细胞予VitC500 μmol/L及5μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 的原花青素预培养24 h。所有的实验至少重复3次。
1.2.3 细胞MTT测定 细胞接种于96孔板,同前分组及处理。取各组细胞,每组加入20 μl MTT(5 mg/ml)后,5%CO2,37 ℃孵箱中继续孵育4 h,吸去每孔中培养液后加入DMSO 150 μl,放置摇床上低速振荡10 min,待结晶物充分溶解后在酶标仪上490 nm处测定每孔细胞OD值。
1.2.4 LDH、NO、MDA量的测定 细胞接种于24孔板,同前分组及处理,均按照试剂盒所述方法稍作改变,在多功能全波长酶标仪下测定各组OD值,通过公式计算分别求出被测样品中的 LDH、NO、MDA含量 ......
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