雄黄对MRL/lpr狼疮小鼠抗ds—DNA抗体和T细胞表面分子CD69、CD25表达的影响(2)
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1 材料与方法
1.1 实验材料 天然雄黄纳米颗粒，购自上海延真纳米材料科技发展有限公司，用双蒸水配成混悬液，低中高剂量组浓度分别为：0.01 mg/ml，0.02 mg/ml，0.03 mg/ml。ConA，美国Sigma-Aldrich公司。anti-mouse-CD3、anti-mouse-CD69和anti-mouse-CD25单克隆荧光抗体，美国Santa-cruz公司。RPMI1640完全培养液、胎牛血清等培养品，英国Gibico公司。GC-1200C放射免疫计数器，购自北方生物技术研究所。MRL/lpr狼疮小鼠，4周龄，雌性，购自上海实验动物中心。流式细胞仪，美国BeckmanCoulter公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物及分组 选择实验模型小鼠100只，随机将其分为空白对照组，纳米雄黄低、中、高剂量组，每组各25只。空白对照用蒸馏水0.2 ml，纳米雄黄各组均用0.2 ml混悬液，每天灌胃一次。所有动物均饲养在同一动物房，自由饮食活动。
1.2.2 小鼠生存时间和体重的观察 两组分别于实验开始后第0、15、30、45、60、75、90天取血检测血清指标，生存时间观察至第180天。
1.2.3 血清的采集和抗双链DNA(ds-DNA)抗体测定 所有小鼠均于实验设计点采取尾血标本并称体重，血清分离后于-70℃保存待测抗ds-DNA抗体。采用GC-1200C放射免疫计数器测定抗dsDNA抗体的效价，严格按照试剂说明书进行操作。
1.2.4 淋巴细胞悬液的制备 实验结束后，将各组MRL/lpr小鼠断髓处死，无菌分离小鼠的双侧颌下、腋窝、浅腹股沟及肠系膜淋巴结，200目筛网过滤，收集细胞，用冷PBS洗涤细胞两次(250×g，5 min)后，细胞重悬于RPMI1640完全培养液中，调整细胞密度为2×109·L-1，0.2%台盼蓝染色判断活细胞百分率达97%。
1.2.5 淋巴细胞培养 将密度为2×109·L-1淋巴细胞悬液接种在24孔细胞培养板上，每孔1 ml，然后分别加入多克隆刺激剂ConA (终浓度5 μg/ml)，在37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h。
1.2.6 T细胞表面活化分子CD69、CD25的检测 采用直接免疫荧光标记法染色，取出各孔细胞悬液离心浓缩后加入anti-mouse-CD3-PE、anti-mouse-CD69-FITC或anti-mouse-CD25-FITC 1μg/106细胞，混匀后，4 ℃避光作用30 min，PBS洗涤细胞两次(250×g，5 min)，以4%多聚甲醛固定，24 h内进行流式细胞仪检测。
1.2.7 流式细胞仪检测及分析 全部数据经Beckman Coulter流式细胞仪和Protocol软件获取，每管样品检测10 000个细胞，获得的数据用Protocol软件分析。
1.3 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，根据资料特征，两样本均数的比较采用t检验或秩和检验，多组间比较采用Oneway-ANOVA，两组间比较用非配对Students t-test，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 雄黄对各组MRL/lpr狼疮小鼠生存时间的影响见表1。
表1 雄黄对各组MRL/lpr狼疮小鼠生存时间的影响 只(%)
组别存活小鼠数
实验90 d实验180 d
对照组(n=25)17(68) 9(36)
低剂量组(n=25)18(72) 12(48)*
中剂量组(n=25)19(76) 14(56)*
高剂量组(n=25)20(80) 17(68)*△
*与对照组同期比较，P<0.05；△与低剂量组比较，P<0.05
从表1可以看出，实验90 d时，雄黄低、中、高剂量组分别存活18、19、20只(72%、76%、80%)和对照组17只(68%)，但各实验组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；至180 d时，雄黄低、中、高剂量组分别存活12、14、17只(48%、56%、68%)，对照组存活9只(36%)，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组两两组间比较，只有高剂量组与低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 各组实验前后MRL/lpr小鼠血清抗ds-DNA效价和体重比较见表2 ......
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