脊髓损伤后大鼠甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的达及甲基强的松龙干预后的变化(2)
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参见附件。
1.3 逆转录PCR反应
1.3.1 脊髓神经细胞总的RNA使用Trizol液提取 1 ml Trizol液中加入1 g组织，反复吹打数次。混合均匀后加入0.2 ml氯仿，并予以离心(12 500 r/min，10 min)。吸取上部清液，加入0.5 ml异丙醇，离心(12 500 r/min，10 min)。
沉淀物加入30 μl DEPC溶化。
1.3.2 RNA定量和鉴定 紫外分光光度计定量RNA，计算OD260、OD280及比值。取总RNA3 μg，电泳(琼脂糖凝胶)30 min，使用紫外光显示28 s及18 s两条rRNA带，说明RNA提取完整性好。
1.3.3 以Vector NTI Suite软件设计检测引物 引物序列：正义：5’TTGCGTGCTGCTATAGTGG 3’，反义：
5’ ACTGCGCCACGAATTTGGG 3’，扩增产物长度：
254bp。β-Actin检测引物序列如下：正义：5’ GGGCAATGG
TCAGTAGGAT 3’(176-196)，反义：5’ CAGTGTGTGACGAG
TCCGT 3’(277-257)。扩增长度为264 bp。
1.3.4 用One-tube RT-PCR system(Roche公司)进行一步法反转录和扩增。
1.4 取5 μl PCR扩增产物电泳，扫描DNA密度，分析基因表达的相对丰度。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件在计算机上进行分析。计量资料以(x±s)表示，两组间采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
假手术组GDPA的mRNA的表达的相对丰度为1.5403±0.1604；脊髓损伤24 h后创伤组GDPA的表达的相对丰度为0.5994±0.3414，与假手术组相比差异有非常显著统计学意义(P<0.01)；GDPA在脊髓损伤后使用甲强龙干预组中的表达相对丰度为1.8432±0.1294，与创伤组比较差异有非常显著统计学意义(P<0.01)。表明大剂量甲基强的松龙的早期使用能促进脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达恢复，发挥细胞保护作用。(表1，图1)。β-Actin的RT-PCR结果见图2，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR结果见图3。
表1 脊髓损伤后24 h二肽氨基肽酶表达情况(x±s)
组别表达相对丰度
假手术组1.5403±0.1604
创伤组0.5994±0.3414
甲强龙组1.8432±0.1294
图1 GPDA表达的相对丰度
图2 β-Actin的RT-PCR结果
图3 甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR结果
注：M1： 50bp ladder， sangon 公司产品；M2： DL-2000 marker， Takara公司产品
3 讨论
外伤后脊髓的功能完全恢复的可能性是比较小的，在受到外伤后很短时间内就会发生继发性的损伤，所以给予早期保护治疗非常的重要。甲基强地松龙为激素类药物，其可对此疾病进行治疗，现今多应用于急性脊髓损伤的早期治疗。
早在1966年，Hopsu-Havu等[3]发现甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶。而后多位专家经过分析证明了该酶的活性[4]。为了探索其他哺乳动物组织中是否含有此酶， 他们首先以鼠肝为样品进行了研究，同样证实在鼠肝和鼠肾中都存在这种新的二肽氨基肽酶，即现在所称的GPDA[5-6]。
文中建立的模型应用打击法，造成模型脊髓损伤，此模型和人体受到外伤的情况比较相似，相关性比较好。本研究发现脊髓组织有甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达，脊髓损伤24 h后，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达显著降低，大剂量甲基强的松龙能促进甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达，到达治疗效果。
参考文献
[1] Park S J，Oh I S，Kwon J Y，et al.The effect of irradiation and methylprednisolone in spinal cord injured rats[J] ......
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