天然化合物抗肿瘤活性研究
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【摘要】 目的：利用MTT法检测天然化合物对肿瘤细胞的杀伤作用，寻找有抗肿瘤潜力的先导化合物。方法：药物和细胞按所需浓度于96孔板中，恒温培养48 h，加入5μg/ml MTT溶液20μl/孔，4 h后吸弃100μl/孔上清液，加入MTT裂解液100μl/孔，孵育过夜，用酶标仪检测各孔吸光值，根据Reed and Menuch法计算IC50值。结果：在对人肝癌细胞株HepG2的毒性试验中，化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22对细胞的抑制率均略低于50%，而阳性对照药物DDP则有明显的抑制肿瘤活性。结论：化合物Qiu17，Qiu33，Qiu22有一定的的抗肿瘤活性作用性。
【关键词】 天然化合物； 抗肿瘤； MTT
肿瘤通常分为良性与恶性，恶性肿瘤，即为癌症，长久以来危及着人类的生命健康，病死率居各类疾病之首，占全球人类死亡总数的12%。目前对肿瘤疾病的治疗中，手术治疗和放射治疗占有很大比重。但由于肿瘤易出现扩散和转移，致使在治疗过程中束手无策。目前临床使用的放射疗法和药物治疗由于选择性较低，杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也有着不同程度的杀伤作用，使机体免疫功能减退、白细胞下降、免疫球蛋白水平下降而影响免疫功能；药物治疗也存在着巨大的缺陷，大多抗肿瘤药物具有骨髓抑制、胃肠道反应、心肌毒性、神经系统毒性、肾毒性等全身性的毒副作用[1]。长期使用不仅给身体带来严重的不良反应，并且还将导致肿瘤细胞形成多药耐药性(MDR)。肿瘤细胞的耐药性是化疗失败的主要原因之一，成为药物治疗癌症的难题，因此研发新的更好的抗肿瘤药物是生物医学领域的重要课题。同时，随着科学技术、分子生物学、分子药理学的快速发展及各个学科领域的相互渗透，抗肿瘤药物的研究与开发抗肿瘤药物已进入一个崭新的时代[2]。
1 材料与方法
1.1 仪器 Bio-rad680酶标仪，Water Jacketed CO2 Incubator，ClassⅡBiological Safety Cabinets and Laminar Airflow Workstation，荧光倒置显微镜(Nikon)，单道移液器、多道移液器，枪头，96孔板、冻存管，血球计数板(71103)，Eppendorf样品管等。
1.2 细胞株 人肝癌细胞(HepG2细胞)(中科院上海细胞库)。
1.3 药物及试剂 化合物Qiu17，Qiu22，Qiu33(中科院昆明植物所植化实验室)；DDP(美国sigma)。改良型RPMI-1640培养基，胎牛血清，胰酶，MTT液、20%SDS-50%DMF，PBS缓冲液，冻存液等。
1.4 方法
1.4.1 HepG2细胞的复苏、传代 将冻存管取出迅速将其放入37.0 ℃的水浴锅中快速搅拌融化，取出消毒并于超净台，用移液器吸出细胞液1 ml于培养皿中，再用电动加样器加入9 ml培养液，逐渐稀释细胞液，并吹打均匀，放入37.0 ℃、5% CO2培养箱中培养并观察。待肿瘤细胞贴比率达80%～90%时取出已复苏细胞，吸尽上清，加入1 ml PBS进行润洗，吸尽PBS，加入1 ml胰酶进行消化，2～3 min后镜检原先贴壁的细胞逐渐变圆，立即吸尽胰酶加入5 ml含10%血清的完全培养液终止消化，吹打均匀后取1 ml于新培养皿中，加入9 ml培养液吹打均匀后培养，传代4次后取对数生长期的细胞进行实验。
1.4.2 细胞冻存 取对数期的细胞进行消化处理，吸弃胰酶，加入冻存液。贴壁细胞不需离心直接加入冻存液吹打均匀后用移液器取1 ml细胞液加入冻存小管；悬浮细胞需离心后用冻存液进行重悬再加入冻存管。
1.4.3 MTT法的细胞毒性试验
1.4.3.1 接种细胞 取出装有HepG2细胞的培养皿，吸弃培养液，PBS洗涤后加入胰酶进行消化。细胞消化后取培养液4 ml进行重悬。重悬吹打均匀后迅速取微量20μl于血球计数板上，于倒置显微镜上进行计数，计算出细胞悬液的浓度，并取量稀释至1×105个/ml。
用排枪取细胞液100μl/孔分别加入新的96孔板中，除边缘不加，第12列三个孔作为空白对照，只有培养液200μl/孔。另外三个空作为阴性对照只有细胞液100μl/孔和培养液100μl/孔。边缘的其余孔分别加入200μl/孔的PBS。细胞接种完后置于培养箱中8 h，使之贴壁完全。
1.4.3.2 配药 从-20℃的低温冰箱中取出事先用DMSO溶解的化合物，融化并稀释成所需浓度，吸入灭过菌的Eppendorf样品管中，并标记Qiu17，Qiu33，Qiu22，DDP。前三种化合物储存液与工作液的配比均为4∶496，DDP为72：378。分别将最高浓度的4种待测化合物用移液器转移至96孔板中除边缘的第11、6列中。每一种药设3个复孔，加药量145μl/孔，其余孔加入120μl/孔的培养液。5倍梯度稀释成5个浓度。Qiu17，Qiu33，Qiu22三药的浓度依次为0.064、0.32、1.6、8、40μM，DDP为0.16、0.8、4、20、100μg/ml。
1.4.3.3 加药、呈色、比色 用排枪从先前配好药的96孔板中分别取100μl药液于贴壁的培养板中，浓度从左往右一次升高，培养48 h，在培养结束前4 h加入MTT液20μl/孔。小心吸弃培养的上清液100μl/孔，再加入20%SDS-50%DMF于培养箱中培育7～8 h。紫色结晶充分溶解后取出，摇床上震摇10 min，选择波长595nm，在Bio-rad680酶标仪上测定各孔的光吸收值即OD值，记录结果。
2 结果
2.1 检测报告各孔OD值见表1。
2.2 四种药物对HepG2的凋亡作用见图1。化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22对细胞的抑制率均低于50%，有但没有较为明显的抗肿瘤的作用，而顺铂(DDP)有明显的抑制作用。
图1 四种药物对HepG2的凋亡作用
3 讨论
由检测报告的数据来看，每一种药物对细胞均有不同程度的杀伤作用，并且随着药物浓度的升高细胞存活率降低。但是化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22对细胞的抑制率均低于50%，有但没有明显的抗肿瘤的作用，而顺铂(DDP)有明显的抑制作用。通过计算得出IC50值为1.694μg/ml，此浓度在0.8～4 μg/ml的范围之内。IC50即半数抑制浓度，是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需要的药物浓度[3]。从表中可以看到 ......
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