MHV—3诱导小鼠暴发性肝炎模型中γδT细胞的抑制性受体表达(1)
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【摘要】 目的：通过分析在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎模型中，小鼠感染病毒前后γδT细胞其抑制性受体NKG2A表达情况，以此探讨爆发性肝炎初期疾病急速恶化的机制。方法：建立MHV-3诱导小鼠暴发性肝炎模型，观察小鼠的死亡率；并检测在不同感染时间点0 h、12 h、24 h、48 h时对小鼠肝组织行伊红-苏木精染色(HE染色)，观察肝脏病理学改变，ALT和AST水平。流式细胞学方法，标记γδT细胞，并标记其NKG2A的表达。结果：MHV-3诱导小鼠暴发性肝炎模型中，γδT表面所表达活化性受体NKG2A表达维持低水平。结论：小鼠爆发性肝炎初期，肝脏重要的天然免疫效应细胞γδT细胞细胞表面抑制性受体NKG2A维持低水平表达，提示机体负调控机制缺失，导致γδT细胞可抑制性低下，最终引起免疫失衡。
【关键词】 暴发性肝炎； 3型鼠肝炎病毒； γδT细胞； γδT细胞抑制； NKG2A
重型肝炎依发病基础分为急性重型肝炎(暴发性肝衰竭)、亚急性重型肝炎(亚暴发性肝衰竭)及慢性重型肝炎。国内普遍认为暴发性肝衰竭、亚暴发性肝衰竭的时限分别为14 d内、15 d～24周(半年)。其中急性重型肝炎(暴发性肝衰竭)死亡率高达70%以上。有研究证实，3型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain 3， MHV-3)诱导的小鼠暴发性肝炎，其病程转归及疾病预后和急性肝衰竭相似，因此该模型是研究急性重型肝炎良好的动物模型之一。肝脏是不仅是机体重要的消化器官也是重要的免疫器官，其中含有大量参与特异性免疫以及非特异性免疫的免疫细胞。T细胞免疫应答在感染性疾病中发挥着抗感染和清除外来病原微生物的重要作用。根据TCR两条肽链构成的不同，可将T细胞分为αβT细胞和γδT细胞，αβT细胞在获得性免疫应答中发挥重要作用；而γδT细胞由于其分布特点和应答的非MHC限制性，在固有性免疫中发挥着独特的作用[2]。γδT细胞的功能调控(如NKG2D、NKG2A等相关分子)，在天然免疫阶段具有相当的意义[3]。NKG2A作为γδT细胞的抑制性受体，其表达的改变，对疾病的进展有一定的意义。本试验利用MHV-3感染BALB/cJ小鼠，建立小鼠爆发性肝炎模型，通过检测小鼠肝脏中γδT细胞表面抑制性受体NKG2A分子表达，探求爆发性肝炎可能的干预途径。
1 材料与方法
1.1 材料 BLAB/cj 小鼠(雌性，6～8周龄)购于北京利华(实验动物)有限公司。饲养于华中科技大学同济医学院附属同济医院感染性疾病研究所(感染免疫实验室)，SPF级，温度25 ℃，湿度70%。
1.2 试剂与仪器 MHV-3原种来自美国育种保育中心(Rockville，MD， USA)，在本实验室以L2型单层种细胞进行扩增。可以以无菌PBS或生理盐水配置成合适浓度，用于模型建立。流式细胞仪分析不同荧光标记的抗小鼠单克隆抗体。CD3e，γδTCR，NKG2A，NKG2Aiso(分别以PECy-5.5，APC，PE进行标识)抗体均购于eB ioscience公司；无菌生理盐水购于上海百特医药公司；无菌PBS为自行配制；Percoll购自Pharmacia公司。流式细胞仪购于BD公司，为本实验室固定财产。
1.3 方法
1.3.1 建立暴发性肝炎小鼠动物模型 MHV-3以无菌生理盐水重悬配置，制备感染液，合适浓度为500 PFU/ml。以腹腔注射方式感染小鼠感染每只小鼠腹腔注射200 μl感染液(100 PFU感染每只小鼠)。不同时间点3～10只，每次实验重复3次。对照组以无菌生理盐水以同等剂量注入小鼠腹腔。
1.3.2 小鼠肝脏非实质细胞获得 脊椎脱臼处死不同组别小鼠，取出小鼠肝脏。将肝脏置于不锈钢滤网( 200目) 上， 用1 ml注射器吸取生理盐水反复冲洗，轻柔碾碎， 使得细胞经网进入平皿的PBS中，得到细胞悬液；500 r/min，离心机离心5 min，留取悬浮液，去沉淀；再次1500 r/min，离心机离心10 min，留取沉淀。取沉淀与10 ml 40% Percoll(原液与无菌PBS配制成) 充分混匀，离心。弃去上清，留取沉淀；用Tris-NH4Cl破去红细胞，PBS充分润洗；重悬后，即得肝脏小鼠非实质细胞悬液。
1.3.3 小鼠外周血清ALT以及AST的检测 取小鼠外周血，于华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科化验室进行检测。
1.3.4 小鼠肝脏病理切片制作 取小鼠肝脏，于福尔马林液中固定，于武汉谷歌生物有限公司进行伊红-苏木精染色(HE染色)，并拍照。
1.3.5 细胞表型分析 收集待测细胞，离心，弃去上清。用PBS重悬混匀细胞，加入荧光标记的抗体，分别标记CD3e，γδTCR，NKG2A，NKG2Aiso，室温避光孵育20～30 min， 用PBS洗2次， 流式细胞仪上机分析。
1.4 观察指标 感染组小鼠死亡时间以及个时间点死亡率。检测小鼠外周血清ALT、AST含量。取小鼠肝脏制作HE病理切片后观察肝脏病理变化。流式细胞仪观察各组小鼠肝脏非实质细胞γδT细胞表达NKG2A受体的差异性。
1.5 统计学处理 使用SPSS 2.0统计学软件分析，并用GraphPad Prism作图软件进行绘制。计量资料以(x±s)表示，采用t检验或者ANOVA统计学方法分析数据 ......
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