妊娠期糖尿病母婴血清及胎盘内脂素变化及其与胎儿生长发育的相关性研究(2)
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1.2.4.1 总RNA提取 取面积为0.5 cm×0.5 cm大小的组织样本在低温液氮环境下研碎，用Trizol(Invitrogen)法提取总RNA。脱氧核糖核酸酶Ⅰ去除混杂的基因组DNA。NanoDrop测定RNA浓度，测得所提取的RNA OD 260/OD 280在1.8～2.0之间。1%琼脂糖凝胶电泳见28、18 s和5 s RNA条带清晰，表明RNA相对分子纯度良好，无降解。
1.2.4.2 Real-time PCR反应 参照逆转录试剂盒(Takara)操作说明书合成10 μL cDNA，采用两步法Real-time PCR试剂盒(SYBR Green)(Takara)扩增内脂素及内参磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因片段。内脂素基因扩增引物序列，上游：5’-TGGAAACCCTCTTGACTGTGT-3’，下游：5’-GACGTTAATCCCAAGGCCATTAG-3’，PCR扩增片段长度为298 bp。内参照GAPDH 引物序列，上游：5’-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3’，下游：5’-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3’，PCR扩增片段长度为146 bp。所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成。循环条件为95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40个循环。使用Roche 480实时荧光定量PCR仪测出样品内脂素及GAPDH的Ct值。用双△Ct法计算内脂素mRNA相对于GAPDH的丰度。
1.3 统计学处理 使用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以(x±s)表示 ......
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