氟化物联合五倍子水提取物对变形链球菌影响的体外研究(2)
1.3 培养基制备 采用含5%蔗糖的胰蛋白酶水解物-大豆液体培养基(TS)，培养基主要成分为：胰蛋白酶、大豆胨、酵母提取物、氯化钠、盐酸半胱氨酸及蔗糖，以氢氧化钠将培养基pH值调到7.6，高压蒸汽灭菌[10]。所用试剂均为分析纯。
1.4 氟化钠的配制 将NaF粉末置干燥箱110 ℃烘干2 h，冷却后称取5 g，加去离子水至50 mL，配制10% NaF溶液，采用逐级稀释法分别将溶液稀释到0.2%、0.1%，滤过灭菌。
1.5 五倍子水提取物 取适量五倍子原药材，敲开后去除虫垢及杂质，冲洗、清洁、干燥，粉碎后过28目筛，称取50 g，加无离子水100 mL，室温下浸泡24 h，过滤4000 r/s离心5 min，取上清液，共离心2次。将上清液冷冻干燥，所得干粉视为五倍子水提取物纯品应用，根据需要配制不同浓度水提取物溶液，分装60Co照射后4 ℃冰箱备用。将五倍子冻干粉按液体二倍稀释法溶于含5%蔗糖的TS液体培养基中，终末浓度分别为10、5、2.5 mg/mL。
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1.6 方法 (1)菌液复苏：取100 mL TS液体培养基，加入50 μL冻存的标准菌液，90% N2、10% CO2条件下，37 ℃恒温培养48 h，获得浓菌液。(2)接种培养：取10 mL的无菌培养管120支，分为12组，对照组1组，实验组11组，每组各10支。在每组各管内先分别加入液体培养基4 mL，浓菌液0.5 mL，然后对照组加入无菌去离子水，实验组各组分别加入0.1%、0.2%NaF溶液及10、5、2.5 mg/mL五倍子水提取物共5 mL，使各组内实验试剂含量分别为：①0.01% NaF；②0.01% NaF+0.25 mg/mL五倍子；③0.01% NaF+0.5 mg/mL五倍子；④0.01% NaF+1 mg/mL五倍子；⑤0.02% NaF；⑥0.02% NaF+0.25 mg/ml五倍子；⑦0.02% NaF+0.5 mg/mL五倍子；⑧0.02% NaF+1 mg/mL五倍子；最后三组各含0.25、0.5及
1 mg/mL五倍子。将各管振荡混匀，将培养管置90% N2、10% CO2条件下，37 ℃恒温培养48 h。(3)检测：将培养液振荡混匀，取3 mL于分光光度计下测各管菌悬液在540 nm处光密度值(OD值)；剩下的2 mL再次充分混匀，以复合pH电极测试其pH值，并计算培养前后培养液pH的变化(△pH)。
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1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料采用(x±s)表示，单因素方差分析比较各组的OD值及pH变化值(△pH)，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对细菌生长的影响 以OD值反映细菌的生长情况。与对照组相比，在含NaF及五倍子的各培养管中，细菌的生长均受抑制，培养液的OD值较对照组降低，且随着NaF及五倍子浓度的升高，培养液中OD值呈浓度依赖性减小，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；当NaF与五倍子联合应用时OD值变化与各对应浓度单独应用时相比略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.2 对变链菌产酸代谢的影响 以各管培养液在培养前后pH的变化(△pH)来反映变链菌的产酸代谢情况。结果显示，对照组培养基pH明显下降，表明该管内变链菌的产酸代谢活跃；而含NaF及五倍子的各培养管内变链菌的产酸则受到抑制，培养前后培养基pH的变化减小，且随着浓度的升高，其△pH呈降低趋势，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；当NaF与五倍子联合应用时△pH变化与各对应浓度单独应用时相比略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。
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3 讨论
自上世纪40年代Dean等[1]首次提出氟化物防龋作用以来，学者们对氟化物作为防龋药物在使用方法、给药形式以及防龋机理等方面都进行了广泛深入研究，在应用氟化物有效预防龋病的同时，氟牙症、氟中毒等不良影响也成为困扰学者们的一个问题[4，11]。
近年来，中药防龋逐渐受到国内外学者的关注[12-13]。已有研究表明五倍子及其主要成分鞣酸具有抑制葡糖基转移酶活性，抑制细菌合成胞外基质的形成，从而抑制变链菌生长、产酸、黏附的能力；另外，还能防止釉质表面脱矿、提高釉质抗酸蚀的能力，其效果与氟化钠相当[5-7，14-15]。
本研究旨在探讨氟化物与五倍子水提取物联合应用时对变形链球菌生长及产酸代谢的影响，实验中的选用了NaF的浓度分别为0.01%和0.02%，是因为目前常用的，被认为较为安全的氟化物漱口液的浓度一般为114 ppm和228 ppm，将五倍子水提取物与接近安全阈值的氟化物联合应用得出的结论更能指导今后的临床应用。有研究表明当五倍子水提取物的浓度>0.5 mg/mL时可抑制变形链球菌的生长及产酸代谢活动。在本实验浓度下五倍子的抑菌作用略弱于氟化物，但两者的抑菌作用差异无统计学意义(P>0.05)。
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本实验结果提示五倍子是有效的防龋药物，在龋病预防中具有一定的应用前景，实验未发现其与氟化物具有协同的防龋效应，两者之间是否有相互的协同效应还待对更多不同浓度的联合应用、五倍子其他剂型(如煎剂，甲醇或乙醇提取物等)以及其对牙体硬组织脱矿及再矿化的影响等方面进行进一步深入研究[16-17]。笔者相信，鲜有副作用且产量丰富的天然药物五倍子，其在防治龋病的领域中的应用会越来越广泛。
参考文献
[1] Dean H T，Arnold F A，Jay P，et al.Studies on mass control of dental caries through fluoridation of the public water supply[J].Public Health Rep，1950，65(43)：1403-1408., http://www.100md.com(徐小娟等)
1.4 氟化钠的配制 将NaF粉末置干燥箱110 ℃烘干2 h，冷却后称取5 g，加去离子水至50 mL，配制10% NaF溶液，采用逐级稀释法分别将溶液稀释到0.2%、0.1%，滤过灭菌。
1.5 五倍子水提取物 取适量五倍子原药材，敲开后去除虫垢及杂质，冲洗、清洁、干燥，粉碎后过28目筛，称取50 g，加无离子水100 mL，室温下浸泡24 h，过滤4000 r/s离心5 min，取上清液，共离心2次。将上清液冷冻干燥，所得干粉视为五倍子水提取物纯品应用，根据需要配制不同浓度水提取物溶液，分装60Co照射后4 ℃冰箱备用。将五倍子冻干粉按液体二倍稀释法溶于含5%蔗糖的TS液体培养基中，终末浓度分别为10、5、2.5 mg/mL。
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1.6 方法 (1)菌液复苏：取100 mL TS液体培养基，加入50 μL冻存的标准菌液，90% N2、10% CO2条件下，37 ℃恒温培养48 h，获得浓菌液。(2)接种培养：取10 mL的无菌培养管120支，分为12组，对照组1组，实验组11组，每组各10支。在每组各管内先分别加入液体培养基4 mL，浓菌液0.5 mL，然后对照组加入无菌去离子水，实验组各组分别加入0.1%、0.2%NaF溶液及10、5、2.5 mg/mL五倍子水提取物共5 mL，使各组内实验试剂含量分别为：①0.01% NaF；②0.01% NaF+0.25 mg/mL五倍子；③0.01% NaF+0.5 mg/mL五倍子；④0.01% NaF+1 mg/mL五倍子；⑤0.02% NaF；⑥0.02% NaF+0.25 mg/ml五倍子；⑦0.02% NaF+0.5 mg/mL五倍子；⑧0.02% NaF+1 mg/mL五倍子；最后三组各含0.25、0.5及
1 mg/mL五倍子。将各管振荡混匀，将培养管置90% N2、10% CO2条件下，37 ℃恒温培养48 h。(3)检测：将培养液振荡混匀，取3 mL于分光光度计下测各管菌悬液在540 nm处光密度值(OD值)；剩下的2 mL再次充分混匀，以复合pH电极测试其pH值，并计算培养前后培养液pH的变化(△pH)。
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1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料采用(x±s)表示，单因素方差分析比较各组的OD值及pH变化值(△pH)，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对细菌生长的影响 以OD值反映细菌的生长情况。与对照组相比，在含NaF及五倍子的各培养管中，细菌的生长均受抑制，培养液的OD值较对照组降低，且随着NaF及五倍子浓度的升高，培养液中OD值呈浓度依赖性减小，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；当NaF与五倍子联合应用时OD值变化与各对应浓度单独应用时相比略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.2 对变链菌产酸代谢的影响 以各管培养液在培养前后pH的变化(△pH)来反映变链菌的产酸代谢情况。结果显示，对照组培养基pH明显下降，表明该管内变链菌的产酸代谢活跃；而含NaF及五倍子的各培养管内变链菌的产酸则受到抑制，培养前后培养基pH的变化减小，且随着浓度的升高，其△pH呈降低趋势，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；当NaF与五倍子联合应用时△pH变化与各对应浓度单独应用时相比略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。
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3 讨论
自上世纪40年代Dean等[1]首次提出氟化物防龋作用以来，学者们对氟化物作为防龋药物在使用方法、给药形式以及防龋机理等方面都进行了广泛深入研究，在应用氟化物有效预防龋病的同时，氟牙症、氟中毒等不良影响也成为困扰学者们的一个问题[4，11]。
近年来，中药防龋逐渐受到国内外学者的关注[12-13]。已有研究表明五倍子及其主要成分鞣酸具有抑制葡糖基转移酶活性，抑制细菌合成胞外基质的形成，从而抑制变链菌生长、产酸、黏附的能力；另外，还能防止釉质表面脱矿、提高釉质抗酸蚀的能力，其效果与氟化钠相当[5-7，14-15]。
本研究旨在探讨氟化物与五倍子水提取物联合应用时对变形链球菌生长及产酸代谢的影响，实验中的选用了NaF的浓度分别为0.01%和0.02%，是因为目前常用的，被认为较为安全的氟化物漱口液的浓度一般为114 ppm和228 ppm，将五倍子水提取物与接近安全阈值的氟化物联合应用得出的结论更能指导今后的临床应用。有研究表明当五倍子水提取物的浓度>0.5 mg/mL时可抑制变形链球菌的生长及产酸代谢活动。在本实验浓度下五倍子的抑菌作用略弱于氟化物，但两者的抑菌作用差异无统计学意义(P>0.05)。
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本实验结果提示五倍子是有效的防龋药物，在龋病预防中具有一定的应用前景，实验未发现其与氟化物具有协同的防龋效应，两者之间是否有相互的协同效应还待对更多不同浓度的联合应用、五倍子其他剂型(如煎剂，甲醇或乙醇提取物等)以及其对牙体硬组织脱矿及再矿化的影响等方面进行进一步深入研究[16-17]。笔者相信，鲜有副作用且产量丰富的天然药物五倍子，其在防治龋病的领域中的应用会越来越广泛。
参考文献
[1] Dean H T，Arnold F A，Jay P，et al.Studies on mass control of dental caries through fluoridation of the public water supply[J].Public Health Rep，1950，65(43)：1403-1408., http://www.100md.com(徐小娟等)