舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K—Akt通路的关系(2)
【Key words】 Sufentanil postconditioning； Type Ⅱ diabetes mellitus； Myocardial ischemia-reperfusion injury； PI3K-Akt
First-author’s address：Shanxi Medical University Department of Anesthesia，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.006
随着我国进入人口老龄化社会，糖尿病(diabetes mellitus DM)严重的威胁着人类的健康，已经成为缺血性心脏病最重要的易患因素，糖尿病人群更易罹患冠心病导致的心肌梗死和梗死后并发症[1]。2型糖尿病作为最普遍的糖尿病类型，在糖尿病人群中占有很大的比重。因此，减轻由2型糖尿病因素导致心肌缺血再灌注损伤就显的具有迫切的临床意义。舒芬太尼是一种强阿片类镇痛药，具有消除半衰期短、镇痛作用强、血流动力学影响轻微等优点，被广泛应用于心血管手术的麻醉[2]。研究表明，舒芬太尼后处理可减轻非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤，其机制与PI3K-Akt通路有关[3]，但是舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤是否有保护作用及其与PI3K-Akt通路的关系，目前的研究尚不多见。本实验拟研究舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K-Akt通路的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体重180～200 g，山西医科大学动物实验中心提供。参展文献[4]的方法制备2型糖尿病模型。高糖高脂饲养6周后，腹腔注射链脲佐菌素(批号：905B0314，Solarbio公司)35 mg/kg，72 h后测量空腹血糖≥16.7 mmol/L并伴有糖尿病症状(多食、多饮、多尿、毛发变黄等)即可视为2型糖尿病大鼠模型制备成功，继续高糖高脂饲养2周后可用于本实验。温度18～25℃，湿度50%～60%，自由饮水。
1.2 实验分组 取健康的正常SD大鼠24只，按照随机数字表法将其分为四组(n=6)：非糖尿病假手术组(NDM-S组)、非糖尿病缺血再灌注组(NDM-I/R组)、非糖尿病舒芬太尼后处理组(NDM-SP组)、非糖尿病舒芬太尼后处理+渥曼青霉素组(NDM-SP+W组)。另取造模成功的糖尿病大鼠24只，按照上述方法分为四组(n=6)：糖尿病假手术组(DM-S组)、糖尿病缺血再灌注组(DM-I/R组)、糖尿病舒芬太尼后处理组(DM-SP组)、糖尿病舒芬太尼后处理+渥曼青霉素组(DM-SP+W组)。
, http://www.100md.com
1.3 心肌缺血再灌注模型的制备 参照文献[5]进行大鼠心肌缺血再灌注模型的制备。腹腔注射20%的乌拉坦3 mL/kg麻醉后，仰卧位固定于实验台上，针状电极刺入左、右前肢和右后肢皮下，动态监测Ⅱ导联心电图。行气管切开置管并连接HX-300小型动物呼吸机行机械通气，呼吸机参数设置为：潮气量8～10 mL，吸呼比1：2，频率65 次/min。于左侧胸壁第3～5肋间胸骨左缘0.5 cm处开胸，钝性分离肌肉，剪断肋骨打开胸腔，暴露出心脏并剥离心包膜，以左冠状静脉主干为标志，在左心耳下方可见一明显的血管即为左冠状动脉前降支，用7-0线结扎左冠状动脉前降支，制备心肌缺血再灌注模型。造模成功的标志为：结扎后心尖部缺血发白，心电图ST段抬高，T波高耸，结扎线以下心肌组织发绀并活动减弱；松开结扎线后，心电图抬高ST段或T波逐渐回落，心肌组织反应性充血。上述S组只穿线不结扎；SP组于再灌注前5 min经舌下静脉注射舒芬太尼(批号1130902，宜昌人福医药有限责任公司)1.0 μg/kg；SP+W组于再灌注前5 min分别经舌下静脉注射渥曼青霉素(批号LG10014，北京百灵威科技有限公司)15 μg/kg、舒芬太尼1.0 μg/kg。
, http://www.100md.com
1.4 cTnI的测定 再灌注120 min后，大鼠开腹找到腹主动脉取血2 mL，4 ℃ 4000 rpm/min离心15 min，后移取上清液于-80 ℃冰箱中保存。使用ELISA法检测血清中cTnI浓度(试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供)。
1.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 再灌注120 min后取下心尖组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片。按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供)说明书进行操作：切片后常规脱蜡后用PBS缓冲液漂洗，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，蛋白酶K消化，加TUNEL反应液，漂洗，加酶标抗体，DAB显色，苏木素复染。每张切片光镜(400倍)下随机选取5个高倍视野，计算凋亡指数(apoptotic index，AI)，即凋亡细胞数占心肌细胞总数的百分比，取5个视野的平均值。
1.6 心肌Akt、p-Akt蛋白表达的测定 再灌注120 min后取左心室100 mg，用生理盐水漂洗数次，剪碎后加入裂解液，14 000 g/min离心5 min，取上清液，用BCA法进行蛋白定量。根据蛋白定量结果加入总蛋白样品和上样缓冲液，煮沸5 min，然后在12%分离胶/5%积层胶上进行电泳，用电转仪将凝胶上分离到的蛋白转移到PVDF膜上，5%BCA封闭2 h，用兔抗鼠Akt和p-Akt单克隆抗体(稀释度1：10 000，ABCAM公司，美国)4 ℃孵育过夜，次日用HRP标记的羊抗兔二抗(稀释度1：5000，武汉博士德生物工程有限公司)孵育2 h，加ECL发光液显影。采用凝胶成像系统进行分析，以目的蛋白条带灰度值和GAPDH条带灰度值的比值反映Akt和p-Akt蛋白的表达。
1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以(x±s)表示，多组均数及组间两两比较采用单因素方差分析和最小显著差异法(LSD法)，非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠各指标的比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。, 百拇医药(任强 王建刚 田首元)
First-author’s address：Shanxi Medical University Department of Anesthesia，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.006
随着我国进入人口老龄化社会，糖尿病(diabetes mellitus DM)严重的威胁着人类的健康，已经成为缺血性心脏病最重要的易患因素，糖尿病人群更易罹患冠心病导致的心肌梗死和梗死后并发症[1]。2型糖尿病作为最普遍的糖尿病类型，在糖尿病人群中占有很大的比重。因此，减轻由2型糖尿病因素导致心肌缺血再灌注损伤就显的具有迫切的临床意义。舒芬太尼是一种强阿片类镇痛药，具有消除半衰期短、镇痛作用强、血流动力学影响轻微等优点，被广泛应用于心血管手术的麻醉[2]。研究表明，舒芬太尼后处理可减轻非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤，其机制与PI3K-Akt通路有关[3]，但是舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤是否有保护作用及其与PI3K-Akt通路的关系，目前的研究尚不多见。本实验拟研究舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K-Akt通路的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体重180～200 g，山西医科大学动物实验中心提供。参展文献[4]的方法制备2型糖尿病模型。高糖高脂饲养6周后，腹腔注射链脲佐菌素(批号：905B0314，Solarbio公司)35 mg/kg，72 h后测量空腹血糖≥16.7 mmol/L并伴有糖尿病症状(多食、多饮、多尿、毛发变黄等)即可视为2型糖尿病大鼠模型制备成功，继续高糖高脂饲养2周后可用于本实验。温度18～25℃，湿度50%～60%，自由饮水。
1.2 实验分组 取健康的正常SD大鼠24只，按照随机数字表法将其分为四组(n=6)：非糖尿病假手术组(NDM-S组)、非糖尿病缺血再灌注组(NDM-I/R组)、非糖尿病舒芬太尼后处理组(NDM-SP组)、非糖尿病舒芬太尼后处理+渥曼青霉素组(NDM-SP+W组)。另取造模成功的糖尿病大鼠24只，按照上述方法分为四组(n=6)：糖尿病假手术组(DM-S组)、糖尿病缺血再灌注组(DM-I/R组)、糖尿病舒芬太尼后处理组(DM-SP组)、糖尿病舒芬太尼后处理+渥曼青霉素组(DM-SP+W组)。
, http://www.100md.com
1.3 心肌缺血再灌注模型的制备 参照文献[5]进行大鼠心肌缺血再灌注模型的制备。腹腔注射20%的乌拉坦3 mL/kg麻醉后，仰卧位固定于实验台上，针状电极刺入左、右前肢和右后肢皮下，动态监测Ⅱ导联心电图。行气管切开置管并连接HX-300小型动物呼吸机行机械通气，呼吸机参数设置为：潮气量8～10 mL，吸呼比1：2，频率65 次/min。于左侧胸壁第3～5肋间胸骨左缘0.5 cm处开胸，钝性分离肌肉，剪断肋骨打开胸腔，暴露出心脏并剥离心包膜，以左冠状静脉主干为标志，在左心耳下方可见一明显的血管即为左冠状动脉前降支，用7-0线结扎左冠状动脉前降支，制备心肌缺血再灌注模型。造模成功的标志为：结扎后心尖部缺血发白，心电图ST段抬高，T波高耸，结扎线以下心肌组织发绀并活动减弱；松开结扎线后，心电图抬高ST段或T波逐渐回落，心肌组织反应性充血。上述S组只穿线不结扎；SP组于再灌注前5 min经舌下静脉注射舒芬太尼(批号1130902，宜昌人福医药有限责任公司)1.0 μg/kg；SP+W组于再灌注前5 min分别经舌下静脉注射渥曼青霉素(批号LG10014，北京百灵威科技有限公司)15 μg/kg、舒芬太尼1.0 μg/kg。
, http://www.100md.com
1.4 cTnI的测定 再灌注120 min后，大鼠开腹找到腹主动脉取血2 mL，4 ℃ 4000 rpm/min离心15 min，后移取上清液于-80 ℃冰箱中保存。使用ELISA法检测血清中cTnI浓度(试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供)。
1.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 再灌注120 min后取下心尖组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片。按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供)说明书进行操作：切片后常规脱蜡后用PBS缓冲液漂洗，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，蛋白酶K消化，加TUNEL反应液，漂洗，加酶标抗体，DAB显色，苏木素复染。每张切片光镜(400倍)下随机选取5个高倍视野，计算凋亡指数(apoptotic index，AI)，即凋亡细胞数占心肌细胞总数的百分比，取5个视野的平均值。
1.6 心肌Akt、p-Akt蛋白表达的测定 再灌注120 min后取左心室100 mg，用生理盐水漂洗数次，剪碎后加入裂解液，14 000 g/min离心5 min，取上清液，用BCA法进行蛋白定量。根据蛋白定量结果加入总蛋白样品和上样缓冲液，煮沸5 min，然后在12%分离胶/5%积层胶上进行电泳，用电转仪将凝胶上分离到的蛋白转移到PVDF膜上，5%BCA封闭2 h，用兔抗鼠Akt和p-Akt单克隆抗体(稀释度1：10 000，ABCAM公司，美国)4 ℃孵育过夜，次日用HRP标记的羊抗兔二抗(稀释度1：5000，武汉博士德生物工程有限公司)孵育2 h，加ECL发光液显影。采用凝胶成像系统进行分析，以目的蛋白条带灰度值和GAPDH条带灰度值的比值反映Akt和p-Akt蛋白的表达。
1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以(x±s)表示，多组均数及组间两两比较采用单因素方差分析和最小显著差异法(LSD法)，非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠各指标的比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。, 百拇医药(任强 王建刚 田首元)