高剂量肺痨康对耐多药结核分枝杆菌的抑制作用(2)
1.5 方法
1.5.1 动物造模 100只雌性小鼠按随机原则抽取20只小鼠作为空白对照组后，余下的小鼠全部以尾静脉注射0.4 mL浓度为5×104 CFU/mL的耐药结核菌液造模，穿刺部位压迫止血1 min。
1.5.2 动物分组 造模2周后，进行PPD试验，将试验阳性小鼠随机分为模型组、利福平组、肺痨康组、肺痨康与利福平联合组(后简称：联合组)，共四组，每组20只，分笼饲养，造模小鼠与空白组小鼠隔离饲养。
1.5.3 动物给药 空白对照组、标准菌株组和耐药菌株组均给予同体积生理盐水每日灌胃一次，连续灌胃56 d。利福平组：给予同体积的利福平每日灌胃一次，连续灌胃56 d。肺痨康组：给予同体积的高剂量肺痨康混悬液(6 g/kg)每日灌胃一次，连续灌胃56 d。联合组：给予同体积的利福平及肺痨康混悬液(6 g/kg)每日灌胃一次，连续灌胃56 d。
, 百拇医药
1.5.4 指标测定 各组小鼠治疗前称取质量一次，治疗后每周称取质量一次，观察并记录各组动物的存活时间，分别于治疗8周后处死小鼠，取小鼠全肺和脾脏观察小鼠每个脏器的结核结节，脏器的病理形态学变化(HE染色)，并研磨、稀释后接种于改良罗氏鸡卵平皿培养基上，37 ℃培养4周后观察结核菌数。
HE染色法具体方法为：取下新鲜的动物组织块(一般厚度不超过0.5 cm)投入预先配好的固定液中(10%中性福尔马林溶液)，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，冷却凝固成块即成。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5～8 μm厚度。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45 ℃恒温箱中烘干。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
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1.6 统计学处理 结果采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料结果均以(x±s)表示，组间计量资料比较采用组间t检验，计数资料用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠体重变化及存活时间 与空白组比较，模型组动物死亡时体重明显降低(P<0.05)，通过高剂量痨康组(6 g/kg)、利福平组和联合组治疗后动物死亡时体重与模型组动物死亡时体重比较，各组动物死亡时体重明显升高，其中高剂量肺痨康组、联合组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组动物平均存活天数明显缩短(P<0.05)，经过高剂量痨康组(6 g/kg)、联合组治疗后动物存活天数有所延长，其中高剂量肺痨康组、联合组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
*与模型组比较，P<0.05；△与空白组比较，P<0.05
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2.2 小鼠脏器系数及肺脏结核结点变化 与空白组比较，模型组肺脏系数和肝脏系数明显增加(P<0.05)，脾脏系数降低(P<0.05)，通过高剂量痨康组(6 g/kg)、利福平组和联合组治疗后可以降低肺脏系数和肝脏系数，升高脾脏系数。其中高剂量痨康组、联合组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组小鼠肺部均产生肺部结节，通过高剂量痨康组(6 g/kg)、利福平组和联合组治疗后可以明显减少肺结节的生成，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.3 小鼠脏器病理组织学结果 通过药物造模后各组动物肝、脾和肺部均发现炎性改变，采用高剂量肺痨康，利福平和联合组治疗后可以不同程度缓解肝、脾和肺部炎性病变。见表3。
3 讨论
耐药性肺结核是指耐一种或一种以上抗结核药物的肺结核，属于慢性缓发性传染性疾病，由于药物的滥用及结核杆菌菌种的变异，导致耐多药结核病病例不断增加[4]。据报道目前至少有27.8%的肺结核患者对现有肺结核药物耐药[5]。目前西药对于利福平单耐药结核病以利福平、吡嗪酰胺和链霉素为核心加用乙胺丁醇，根据病史及病变严重程度、确定是否加用氟喹诺酮类药物，至少注射3个月，总疗程不少于9个月[6]。根据相关研究报道利福平单耐药结核病采用标准的治疗方案及多种联合给药均可取得较为满意的临床效果[7-9]。
, 百拇医药
中医学认为耐药性肺结核属于“肺痨”范畴，临床以咳嗽、咯血、潮热、盗汗及身体逐渐消瘦为主要特征[10]。目前中医药已成为抗肺结核的常用药，其中百部、海浮石、大蒜、黄连、夏枯草、狼毒，猫爪草、苦参能增强感染肺结核小鼠的免疫力[11-12]，水车前、猫爪草、苦参具有抑菌作用[13]。中药复方保真汤、百部丸、海浮石丸、抗痨保肺丸、保肺丸、地榆稚草汤、月华丸及百合固金汤，与抗结核西药联合使用可以改善临床症状，减轻抗结核药物的毒副作用，降低耐药率，可以有效应用于耐药性肺结核的治疗[14-23]。
本次实验结果显示高剂量肺痨康、高剂量肺痨康与利福平联合治疗后均能升高耐多药结核模型小鼠的体重，降低升高的肺脏系数和肝脏系数，减少肺部结节数，延长模型小鼠的存活时间。病理结果显示，高剂量痨康，高剂量肺痨康与利福平联合治疗后均可以不同程度缓解肝、脾和肺部炎性改变。对此笔者认为高剂量痨康，高剂量肺痨康与利福平联合后可以通过缓解肝、脾和肺部脏器的炎性反应，从而降低肺脏系数和肝脏系数，进而说明高剂量肺痨康对耐多药结核模型小鼠具有较好的治疗作用，但是起具有治疗作用的机制还有待进一步深入研究。
参考文献
[1]叶品良，卢润生，黄秀深，等.肺痨康治疗肺结核69例[J].江西中医药，2009，40(2)：33.
[2]刘婷婷，叶品良，王帅，等.“肺痨康”对耐多药结核分枝杆菌抑菌效力的体外研究[J].光明中医，2008，2(10)：1453-1454., 百拇医药(陈欢等)
1.5.1 动物造模 100只雌性小鼠按随机原则抽取20只小鼠作为空白对照组后，余下的小鼠全部以尾静脉注射0.4 mL浓度为5×104 CFU/mL的耐药结核菌液造模，穿刺部位压迫止血1 min。
1.5.2 动物分组 造模2周后，进行PPD试验，将试验阳性小鼠随机分为模型组、利福平组、肺痨康组、肺痨康与利福平联合组(后简称：联合组)，共四组，每组20只，分笼饲养，造模小鼠与空白组小鼠隔离饲养。
1.5.3 动物给药 空白对照组、标准菌株组和耐药菌株组均给予同体积生理盐水每日灌胃一次，连续灌胃56 d。利福平组：给予同体积的利福平每日灌胃一次，连续灌胃56 d。肺痨康组：给予同体积的高剂量肺痨康混悬液(6 g/kg)每日灌胃一次，连续灌胃56 d。联合组：给予同体积的利福平及肺痨康混悬液(6 g/kg)每日灌胃一次，连续灌胃56 d。
, 百拇医药
1.5.4 指标测定 各组小鼠治疗前称取质量一次，治疗后每周称取质量一次，观察并记录各组动物的存活时间，分别于治疗8周后处死小鼠，取小鼠全肺和脾脏观察小鼠每个脏器的结核结节，脏器的病理形态学变化(HE染色)，并研磨、稀释后接种于改良罗氏鸡卵平皿培养基上，37 ℃培养4周后观察结核菌数。
HE染色法具体方法为：取下新鲜的动物组织块(一般厚度不超过0.5 cm)投入预先配好的固定液中(10%中性福尔马林溶液)，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，冷却凝固成块即成。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5～8 μm厚度。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45 ℃恒温箱中烘干。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
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1.6 统计学处理 结果采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料结果均以(x±s)表示，组间计量资料比较采用组间t检验，计数资料用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠体重变化及存活时间 与空白组比较，模型组动物死亡时体重明显降低(P<0.05)，通过高剂量痨康组(6 g/kg)、利福平组和联合组治疗后动物死亡时体重与模型组动物死亡时体重比较，各组动物死亡时体重明显升高，其中高剂量肺痨康组、联合组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组动物平均存活天数明显缩短(P<0.05)，经过高剂量痨康组(6 g/kg)、联合组治疗后动物存活天数有所延长，其中高剂量肺痨康组、联合组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
*与模型组比较，P<0.05；△与空白组比较，P<0.05
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2.2 小鼠脏器系数及肺脏结核结点变化 与空白组比较，模型组肺脏系数和肝脏系数明显增加(P<0.05)，脾脏系数降低(P<0.05)，通过高剂量痨康组(6 g/kg)、利福平组和联合组治疗后可以降低肺脏系数和肝脏系数，升高脾脏系数。其中高剂量痨康组、联合组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组小鼠肺部均产生肺部结节，通过高剂量痨康组(6 g/kg)、利福平组和联合组治疗后可以明显减少肺结节的生成，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.3 小鼠脏器病理组织学结果 通过药物造模后各组动物肝、脾和肺部均发现炎性改变，采用高剂量肺痨康，利福平和联合组治疗后可以不同程度缓解肝、脾和肺部炎性病变。见表3。
3 讨论
耐药性肺结核是指耐一种或一种以上抗结核药物的肺结核，属于慢性缓发性传染性疾病，由于药物的滥用及结核杆菌菌种的变异，导致耐多药结核病病例不断增加[4]。据报道目前至少有27.8%的肺结核患者对现有肺结核药物耐药[5]。目前西药对于利福平单耐药结核病以利福平、吡嗪酰胺和链霉素为核心加用乙胺丁醇，根据病史及病变严重程度、确定是否加用氟喹诺酮类药物，至少注射3个月，总疗程不少于9个月[6]。根据相关研究报道利福平单耐药结核病采用标准的治疗方案及多种联合给药均可取得较为满意的临床效果[7-9]。
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中医学认为耐药性肺结核属于“肺痨”范畴，临床以咳嗽、咯血、潮热、盗汗及身体逐渐消瘦为主要特征[10]。目前中医药已成为抗肺结核的常用药，其中百部、海浮石、大蒜、黄连、夏枯草、狼毒，猫爪草、苦参能增强感染肺结核小鼠的免疫力[11-12]，水车前、猫爪草、苦参具有抑菌作用[13]。中药复方保真汤、百部丸、海浮石丸、抗痨保肺丸、保肺丸、地榆稚草汤、月华丸及百合固金汤，与抗结核西药联合使用可以改善临床症状，减轻抗结核药物的毒副作用，降低耐药率，可以有效应用于耐药性肺结核的治疗[14-23]。
本次实验结果显示高剂量肺痨康、高剂量肺痨康与利福平联合治疗后均能升高耐多药结核模型小鼠的体重，降低升高的肺脏系数和肝脏系数，减少肺部结节数，延长模型小鼠的存活时间。病理结果显示，高剂量痨康，高剂量肺痨康与利福平联合治疗后均可以不同程度缓解肝、脾和肺部炎性改变。对此笔者认为高剂量痨康，高剂量肺痨康与利福平联合后可以通过缓解肝、脾和肺部脏器的炎性反应，从而降低肺脏系数和肝脏系数，进而说明高剂量肺痨康对耐多药结核模型小鼠具有较好的治疗作用，但是起具有治疗作用的机制还有待进一步深入研究。
参考文献
[1]叶品良，卢润生，黄秀深，等.肺痨康治疗肺结核69例[J].江西中医药，2009，40(2)：33.
[2]刘婷婷，叶品良，王帅，等.“肺痨康”对耐多药结核分枝杆菌抑菌效力的体外研究[J].光明中医，2008，2(10)：1453-1454., 百拇医药(陈欢等)