S1P通路在胆盐所致HL—7702细胞毒性损伤中的作用(2)
1.2.2 Western blot法检测caspase-3蛋白的表达 接种于60 mm培养皿的HL-7702细胞5×106，给予含GCDC或VPC23019的培养基干预24 h或30 min后，用冷PBS洗两次，加入适量细胞裂解液，4 ℃静置30 min，使用细胞刮子刮下细胞，置入2 mL离心管中，12 000 rpm离心10 min，取上清约2 μL采用BCA法进行蛋白定量，剩余上清液保存于低温冰箱以备电泳。总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭60 min，然后在兔抗人caspase-3抗体(美国Bioworld Technology公司)孵育液中4 ℃过夜，接着与相应的二抗室温孵育90 min。用ECL发光液显色后，暗室曝光到X线片，扫描后用ImageJ 1.410软件进行半定量分析。
1.2.3 双抗体夹心ELISA方法检测上清液S1P的表达 接种于96孔板的HL-7702细胞，给予含GCDC或VPC23019的培养基干预24 h或30 min后，取100 μL细胞培养上清液，加到S1P抗体预先包被的酶标板中，37 ℃培养箱孵育90 min，然后吸去上清液，接着加入S1P抗体继续37 ℃培养箱孵育60 min，TBS漂洗3次后，加入生物素标记的二抗37 ℃培养箱孵育30 min，加入TMB显色，终止液终止反应后，用Multiskan MK3酶标仪(入=450 nm)记录吸光度。取3孔吸光度的平均数，按公式计算上清液S1P的表达。
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1.3 统计学处理 使用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据(mean±SE)表示，组间差异采用单因素方差分析，两两比较按照最小显著性差异进行，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 S1P通路介导GCDC引起的HL-7702细胞毒性 根据笔者前期的实验研究，应用150 mol/L GCDC处理HL-7702细胞24 h建立胆酸盐损伤肝细胞模型，CCK-8试剂盒测定细胞存活率。未经任何处理的对照组细胞存活率为100%，150 μmol/L GCDC组处理HL-7702细胞24 h可明显地产生细胞毒性，使细胞存活率为(60.8±5.2 630)%明显降低，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；1.25 μmol/L及2.5 μmol/L浓度的VPC23019(S1PR1抑制剂)未能抑制GCDC引起的HL-7702细胞毒性作用，细胞存活率分别为(61.6±4.0 373)%、(62.8±4.3 243)%，与GCDC组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；5～20 μmol/L浓度范围内的VPC23019(S1PR1抑制剂)能抑制GCDC引起的HL-7702细胞毒性作用，其中10 μmol/L VPC23019+GCDC预处理30 min的抑制作用最显著，表现为细胞存活率升高分别为(70.2±2.5 884)%、(80.4±2.7 018)%、(70±2.9 154)%，与GCDC组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，见图1。单独10 μmol/L VPC23019预处理对细胞存活率无明显影响。
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2.2 S1P通路介导GCDC引起的HL-7702细胞凋亡 免疫印迹法测定cleaved caspase-3表达(是反映细胞凋亡的一个指标)，未经任何处理的对照组cleaved caspase-3/β-actin比值为(0.5±0.0 894)，150 μmol/L GCDC处理组HL-7702细胞24 h比值为(1.2±0.1 788)可明显地诱导细胞凋亡，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。但是，在GCDC作用HL-7702细胞前，10 μmol/L VPC23019预处理30 min能抑制GCDC对cleaved caspase-3表达的上调作用其比值为(0.8±0.0 894)，可抑制GCDC的促凋亡作用，与GCDC组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。10 μmol/L VPC23019单独处理HL-7702细胞24 h对细胞凋亡无明显的影响，其比值为(0.53±0.0 806)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。
2.3 SphK1抑制剂阻抑GCDC对HL-7702细胞S1P表达的上调作用 ELISA测定培养上清液中S1P的含量，未经任何处理的对照组培养上清液S1P浓度为(119.6±9.3 950)pmol/mL，150 μmol/L GCDC组处理HL-7702细胞24 h可使S1P表达明显增多为(160.3±8.9 442)pmol/mL，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；但是，在GCDC作用HL-7702细胞前，应用10 μmol/L VPC23019预处理30 min可明显地拮抗GCDC对S1P表达的上调作用，上清液S1P浓度为(140.8±7.0 894)S1P，与GCDC组比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示SphK1通路参与了GCDC对S1P表达的上调作用。单独10 μmol/L VPC23019预处理对培养上清液S1P浓度无影响为(121.53±9.0 774)pmol/mL，见图3。
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3 讨论
磷脂是细胞膜的重要组分，主要包含有两大类磷脂，即由甘油构成的甘油磷脂(phosphoglyceride)，由神经鞘氨醇构成的鞘磷脂(sphingolipid)。鞘磷脂(sphingomyelin)是含硝氨醇或二氢鞘氨醇的磷脂，其分子不含甘油，是一分子脂肪酸以酰胺键与鞘氨醇的氨基相连。人体含量最多的鞘磷脂是神经鞘磷脂，由鞘氨醇、脂肪酸及磷酸胆碱构成，常与卵磷脂存在于细胞膜外侧。鞘磷脂的代谢产物为神经酰胺(ceramide，Cer)、鞘氨醇(sphingosine，Sph)和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)等。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是重要的磷脂代谢产物，参与细胞增殖、存活和迁移等广泛的生物学效应。S1P在细胞内由鞘氨醇激酶(SphK)使鞘氨醇磷酸化而形成。S1P代谢的异常调节已经成为多种肿瘤发生发展的重要机制。靶向SphK-S1P信号通路的抑制剂、激动剂及抗体等已经成为众多肿瘤的新治疗策略。越来越多的证据表明，鞘磷脂参与调控细胞的生长、周期和凋亡等，鞘磷脂的重要活性代谢产物1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)，鞘氨醇激酶(sphingosine kinase1，SphK1)是鞘氨醇生成S1P的关键限速酶，SphK1/S1P信号通路在肝细胞存活或凋亡中有重要作用[4-6]。近来有研究表明，胆汁淤积性黄疸引起肝实质细胞损伤是急慢性肝病的病因之一，其中不同浓度的胆汁酸对肝实质细胞的损害程度相同，胆汁酸低浓度时诱导细胞凋亡，高浓度的胆汁酸则可导致细胞坏死[7-9]。细胞内鞘脂代谢平衡对于维持细胞增殖、分化和凋亡发挥重要作用，鞘脂代谢物包括神经酰胺、神经鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸盐等，可作为重要的信号分子，在肝细胞损伤和肿瘤的发生发展中有重要作用[10-17]。, 百拇医药(梁君铭 曾宽 邹堂斌)
1.2.3 双抗体夹心ELISA方法检测上清液S1P的表达 接种于96孔板的HL-7702细胞，给予含GCDC或VPC23019的培养基干预24 h或30 min后，取100 μL细胞培养上清液，加到S1P抗体预先包被的酶标板中，37 ℃培养箱孵育90 min，然后吸去上清液，接着加入S1P抗体继续37 ℃培养箱孵育60 min，TBS漂洗3次后，加入生物素标记的二抗37 ℃培养箱孵育30 min，加入TMB显色，终止液终止反应后，用Multiskan MK3酶标仪(入=450 nm)记录吸光度。取3孔吸光度的平均数，按公式计算上清液S1P的表达。
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1.3 统计学处理 使用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据(mean±SE)表示，组间差异采用单因素方差分析，两两比较按照最小显著性差异进行，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 S1P通路介导GCDC引起的HL-7702细胞毒性 根据笔者前期的实验研究，应用150 mol/L GCDC处理HL-7702细胞24 h建立胆酸盐损伤肝细胞模型，CCK-8试剂盒测定细胞存活率。未经任何处理的对照组细胞存活率为100%，150 μmol/L GCDC组处理HL-7702细胞24 h可明显地产生细胞毒性，使细胞存活率为(60.8±5.2 630)%明显降低，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；1.25 μmol/L及2.5 μmol/L浓度的VPC23019(S1PR1抑制剂)未能抑制GCDC引起的HL-7702细胞毒性作用，细胞存活率分别为(61.6±4.0 373)%、(62.8±4.3 243)%，与GCDC组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；5～20 μmol/L浓度范围内的VPC23019(S1PR1抑制剂)能抑制GCDC引起的HL-7702细胞毒性作用，其中10 μmol/L VPC23019+GCDC预处理30 min的抑制作用最显著，表现为细胞存活率升高分别为(70.2±2.5 884)%、(80.4±2.7 018)%、(70±2.9 154)%，与GCDC组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，见图1。单独10 μmol/L VPC23019预处理对细胞存活率无明显影响。
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2.2 S1P通路介导GCDC引起的HL-7702细胞凋亡 免疫印迹法测定cleaved caspase-3表达(是反映细胞凋亡的一个指标)，未经任何处理的对照组cleaved caspase-3/β-actin比值为(0.5±0.0 894)，150 μmol/L GCDC处理组HL-7702细胞24 h比值为(1.2±0.1 788)可明显地诱导细胞凋亡，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。但是，在GCDC作用HL-7702细胞前，10 μmol/L VPC23019预处理30 min能抑制GCDC对cleaved caspase-3表达的上调作用其比值为(0.8±0.0 894)，可抑制GCDC的促凋亡作用，与GCDC组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。10 μmol/L VPC23019单独处理HL-7702细胞24 h对细胞凋亡无明显的影响，其比值为(0.53±0.0 806)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。
2.3 SphK1抑制剂阻抑GCDC对HL-7702细胞S1P表达的上调作用 ELISA测定培养上清液中S1P的含量，未经任何处理的对照组培养上清液S1P浓度为(119.6±9.3 950)pmol/mL，150 μmol/L GCDC组处理HL-7702细胞24 h可使S1P表达明显增多为(160.3±8.9 442)pmol/mL，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；但是，在GCDC作用HL-7702细胞前，应用10 μmol/L VPC23019预处理30 min可明显地拮抗GCDC对S1P表达的上调作用，上清液S1P浓度为(140.8±7.0 894)S1P，与GCDC组比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示SphK1通路参与了GCDC对S1P表达的上调作用。单独10 μmol/L VPC23019预处理对培养上清液S1P浓度无影响为(121.53±9.0 774)pmol/mL，见图3。
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3 讨论
磷脂是细胞膜的重要组分，主要包含有两大类磷脂，即由甘油构成的甘油磷脂(phosphoglyceride)，由神经鞘氨醇构成的鞘磷脂(sphingolipid)。鞘磷脂(sphingomyelin)是含硝氨醇或二氢鞘氨醇的磷脂，其分子不含甘油，是一分子脂肪酸以酰胺键与鞘氨醇的氨基相连。人体含量最多的鞘磷脂是神经鞘磷脂，由鞘氨醇、脂肪酸及磷酸胆碱构成，常与卵磷脂存在于细胞膜外侧。鞘磷脂的代谢产物为神经酰胺(ceramide，Cer)、鞘氨醇(sphingosine，Sph)和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)等。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是重要的磷脂代谢产物，参与细胞增殖、存活和迁移等广泛的生物学效应。S1P在细胞内由鞘氨醇激酶(SphK)使鞘氨醇磷酸化而形成。S1P代谢的异常调节已经成为多种肿瘤发生发展的重要机制。靶向SphK-S1P信号通路的抑制剂、激动剂及抗体等已经成为众多肿瘤的新治疗策略。越来越多的证据表明，鞘磷脂参与调控细胞的生长、周期和凋亡等，鞘磷脂的重要活性代谢产物1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)，鞘氨醇激酶(sphingosine kinase1，SphK1)是鞘氨醇生成S1P的关键限速酶，SphK1/S1P信号通路在肝细胞存活或凋亡中有重要作用[4-6]。近来有研究表明，胆汁淤积性黄疸引起肝实质细胞损伤是急慢性肝病的病因之一，其中不同浓度的胆汁酸对肝实质细胞的损害程度相同，胆汁酸低浓度时诱导细胞凋亡，高浓度的胆汁酸则可导致细胞坏死[7-9]。细胞内鞘脂代谢平衡对于维持细胞增殖、分化和凋亡发挥重要作用，鞘脂代谢物包括神经酰胺、神经鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸盐等，可作为重要的信号分子，在肝细胞损伤和肿瘤的发生发展中有重要作用[10-17]。, 百拇医药(梁君铭 曾宽 邹堂斌)