重症肺炎患儿继发抗生素相关性腹泻病原菌检测与肠镜观察(2)
1.2 AAD诊断 AAD的诊断按照2001年1月2日卫生部颁发的《医院感染诊断标准(试行)》及McFarland LV标准[4-5]。住院患儿使用抗生素之前均无腹泻症状，全部病例均曾使用1种或2种以上的抗生素。使用抗生素之后均出现大便次数增多，多数为水样便、黏糊便，少数为伪膜样便。AAD患儿的入选标准：(1)入院后应用或正在应用抗生素，出现腹泻，大便次数≥3次/d，可伴大便性状改变如水样便、血便、黏液脓血便或见斑块条索状伪膜，可合并下列情况之一：①发热≥38 ℃；②腹痛或腹部压痛、反跳痛；③周围血白细胞升高。(2)临床诊断基础上，患儿大便涂片可见到有菌群失调或培养发现有意义的优势菌群。(3)患儿大便检测显示与急慢性肠炎相关性的细菌、病毒结果全部为阴性，而且出现大量机会菌变为优势菌。(4)入院前均无腹泻症状，并排除在治疗过程中因食物中毒、细菌性肠炎、病毒性肠炎及护理不当等因素造成的腹泻。
1.3 CD毒素检测 先参考文献[6]在mini-VIDAS全自动免疫仪上采用酶联荧光免疫分析方法对CD的A、B毒素进行初步检测。操作步骤：取300 μL水样便或稀便，加入到900 μL样本稀释液中摇匀，12 000 r/min，离心5 min，离心后不要摇动，取300 μL上清液，如果上清液上有漂浮物应去除，加样本或标准品到mini-VIDAS分析仪试剂条的样本孔内，仪器自动分析结果，1 h报告。质控品、标准品、阳性及阴性对照的操作同样本操作一样。对A、B毒素阳性的标本，使用PCR检测方法进行确认试验：用无菌于棉棒多点蘸取样本，混悬于样本缓冲液中，取10 μL加入到裂解缓冲液中提取核酸[7]。将含有毒素A、B基因和内质控特异性探针的试剂混合物和3 μL裂解液加入到SmartCycler专用试管中，用SmartCycler I-CORE module及Cepheid SmartCycler软件按CD扩增常规方案进行。扩增的DNA靶序列采用不同的探针分别针对靶序列和内质控探针的分子进行检测。阴性和阳性质控与检测标本同时扩增，阴性和阳性检测结果在控为检测结果有效。
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1.4 AAD其他病原菌检测 收集患儿粪便进行志贺氏菌、沙门氏菌、EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、白色假丝酵母菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌及其他条件致病菌的培养，按常规标准方法操作，挑取粪便异常部位分别接种于SS、麦康凯、沙保罗及哥伦比亚血平板上，经35 ℃，24 h培养后分离鉴定。标准菌株为大肠埃希菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，铜绿假单胞菌(ATCC27853)作为质控，标准菌株均购自中国药品生物制品鉴定所。
1.5 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料采用(x±s)表示，比较采用t检验(正态分布)或秩和检验(Mann-Whitne U，非正态分布)，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床表现 (1)腹泻：全部病例均有水样腹泻，3～30余次/d，其中呈豆渣样便74例、黄绿色52例、血性便48例、黏液便35例、其他74例。(2)腹部体征：大部分病例在病变初期有肠鸣音亢进，部分患儿随着病情的加重，肠鸣音逐渐减弱，甚至出现麻痹性肠梗阻。大多数患者年龄偏小，且意识状态差，腹痛及压痛表现无法表述。(3)发热：76例体温37.5～39 ℃。(4)轻至中度腹胀69例，恶心、呕吐54例，其他临床资料见表1。
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2.2 AAD病原菌CD与其他病原菌检测结果比较 CD的毒素A、B之一或A和B全阳性的标本48例，占16.96%(48/283)。在283例AAD患儿粪便标本中有208例粪便标本无志贺氏菌、沙门氏菌、EPEC、EIEC、ETEC、EHEC等致病菌生长，但检出有其他条件致病菌呈优势生长。283例AAD患儿粪便标本的病原菌CD与其他病原菌检出率比较见表2。
表2 AAD病原菌CD与其他病原菌检出率的比较 例(%)
细菌检出数与CD检出数48(16.96%)比较
字2值P值
白色假丝酵母菌127(44.88)56.29<0.01
大肠埃希氏菌114(40.28)37.67<0.01
, http://www.100md.com 金黄色葡萄球菌43(15.19)0.330.57
产气荚膜梭菌35(12.37)2.390.12
产酸克雷伯菌26(9.19)7.52<0.01
阴沟肠杆菌19(8.65)14.24<0.01
肺炎克雷伯菌16(6.71)18.04<0.01
铜绿假单胞菌8(2.83)31.71<0.01
2.3 肠镜观察 AAD患儿中有26例结肠镜检可见黄白色伪膜，见图1 B，其病原学检查均为CD感染。67例结肠镜检均有黏膜充血、水肿，见图1 C、D，其病原学检查均为除CD和白色假丝酵母菌之外的其他病原菌感染，见图1。
3 讨论
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AAD是由于应用抗生素等多种原因导致的机体肠道菌群失衡或优势菌群更替性腹泻，文献[1]报道儿科住院病人的AAD发病率在5%～25%。抗生素的使用导致肠道菌群紊乱是AAD发生和发展的基础。抗生素在杀灭病原菌的同时破坏了肠道的正常菌群，特别是广谱抗生素抑制肠道内的正常菌群，而某些外来细菌或过路菌成为优势菌群，从而引起肠道正常菌群平衡失调。肠道正常菌群平衡失调，不仅影响肠道黏膜消化、吸收和分泌功能，而且会导致肠道菌群移位以及肠道内源性和外源性感染。
儿科患者发生的AAD临床表现较复杂、危险因素不确定[1，8]。如果临床不注意防范，患儿一旦感染CD后会形成CDAD，CDAD的治疗会面临两个难题：(1)CDAD感染性腹泻的复发率高，有的患者复发率达到35%；(2)CDAD容易对常用抗生素甲硝唑和万古霉素产生耐药，以致难以治愈，甚至会导致患儿死亡，因此寻找重症肺炎患儿继发AAD的病原菌因素非常重要[9-10]。笔者研究的283例AAD患儿的临床资料表明，感染CDAD的患儿年龄小、住院时间长、治疗抗生素的时间长，这些资料与AAD患儿比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明越小的患儿，感染CD的可能性越大，使用抗生素的时间和住院时间越长，其他的临床资料，包括白细胞数、中性粒细胞数、C反应蛋白值、抗生素联合应用情况和微生态制剂使用情况在CDAD与AAD之间没有明显区别。, 百拇医药(胡鸿伟 程国平 戴昕 等)
1.3 CD毒素检测 先参考文献[6]在mini-VIDAS全自动免疫仪上采用酶联荧光免疫分析方法对CD的A、B毒素进行初步检测。操作步骤：取300 μL水样便或稀便，加入到900 μL样本稀释液中摇匀，12 000 r/min，离心5 min，离心后不要摇动，取300 μL上清液，如果上清液上有漂浮物应去除，加样本或标准品到mini-VIDAS分析仪试剂条的样本孔内，仪器自动分析结果，1 h报告。质控品、标准品、阳性及阴性对照的操作同样本操作一样。对A、B毒素阳性的标本，使用PCR检测方法进行确认试验：用无菌于棉棒多点蘸取样本，混悬于样本缓冲液中，取10 μL加入到裂解缓冲液中提取核酸[7]。将含有毒素A、B基因和内质控特异性探针的试剂混合物和3 μL裂解液加入到SmartCycler专用试管中，用SmartCycler I-CORE module及Cepheid SmartCycler软件按CD扩增常规方案进行。扩增的DNA靶序列采用不同的探针分别针对靶序列和内质控探针的分子进行检测。阴性和阳性质控与检测标本同时扩增，阴性和阳性检测结果在控为检测结果有效。
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1.4 AAD其他病原菌检测 收集患儿粪便进行志贺氏菌、沙门氏菌、EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、白色假丝酵母菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌及其他条件致病菌的培养，按常规标准方法操作，挑取粪便异常部位分别接种于SS、麦康凯、沙保罗及哥伦比亚血平板上，经35 ℃，24 h培养后分离鉴定。标准菌株为大肠埃希菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，铜绿假单胞菌(ATCC27853)作为质控，标准菌株均购自中国药品生物制品鉴定所。
1.5 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料采用(x±s)表示，比较采用t检验(正态分布)或秩和检验(Mann-Whitne U，非正态分布)，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床表现 (1)腹泻：全部病例均有水样腹泻，3～30余次/d，其中呈豆渣样便74例、黄绿色52例、血性便48例、黏液便35例、其他74例。(2)腹部体征：大部分病例在病变初期有肠鸣音亢进，部分患儿随着病情的加重，肠鸣音逐渐减弱，甚至出现麻痹性肠梗阻。大多数患者年龄偏小，且意识状态差，腹痛及压痛表现无法表述。(3)发热：76例体温37.5～39 ℃。(4)轻至中度腹胀69例，恶心、呕吐54例，其他临床资料见表1。
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2.2 AAD病原菌CD与其他病原菌检测结果比较 CD的毒素A、B之一或A和B全阳性的标本48例，占16.96%(48/283)。在283例AAD患儿粪便标本中有208例粪便标本无志贺氏菌、沙门氏菌、EPEC、EIEC、ETEC、EHEC等致病菌生长，但检出有其他条件致病菌呈优势生长。283例AAD患儿粪便标本的病原菌CD与其他病原菌检出率比较见表2。
表2 AAD病原菌CD与其他病原菌检出率的比较 例(%)
细菌检出数与CD检出数48(16.96%)比较
字2值P值
白色假丝酵母菌127(44.88)56.29<0.01
大肠埃希氏菌114(40.28)37.67<0.01
, http://www.100md.com 金黄色葡萄球菌43(15.19)0.330.57
产气荚膜梭菌35(12.37)2.390.12
产酸克雷伯菌26(9.19)7.52<0.01
阴沟肠杆菌19(8.65)14.24<0.01
肺炎克雷伯菌16(6.71)18.04<0.01
铜绿假单胞菌8(2.83)31.71<0.01
2.3 肠镜观察 AAD患儿中有26例结肠镜检可见黄白色伪膜，见图1 B，其病原学检查均为CD感染。67例结肠镜检均有黏膜充血、水肿，见图1 C、D，其病原学检查均为除CD和白色假丝酵母菌之外的其他病原菌感染，见图1。
3 讨论
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AAD是由于应用抗生素等多种原因导致的机体肠道菌群失衡或优势菌群更替性腹泻，文献[1]报道儿科住院病人的AAD发病率在5%～25%。抗生素的使用导致肠道菌群紊乱是AAD发生和发展的基础。抗生素在杀灭病原菌的同时破坏了肠道的正常菌群，特别是广谱抗生素抑制肠道内的正常菌群，而某些外来细菌或过路菌成为优势菌群，从而引起肠道正常菌群平衡失调。肠道正常菌群平衡失调，不仅影响肠道黏膜消化、吸收和分泌功能，而且会导致肠道菌群移位以及肠道内源性和外源性感染。
儿科患者发生的AAD临床表现较复杂、危险因素不确定[1，8]。如果临床不注意防范，患儿一旦感染CD后会形成CDAD，CDAD的治疗会面临两个难题：(1)CDAD感染性腹泻的复发率高，有的患者复发率达到35%；(2)CDAD容易对常用抗生素甲硝唑和万古霉素产生耐药，以致难以治愈，甚至会导致患儿死亡，因此寻找重症肺炎患儿继发AAD的病原菌因素非常重要[9-10]。笔者研究的283例AAD患儿的临床资料表明，感染CDAD的患儿年龄小、住院时间长、治疗抗生素的时间长，这些资料与AAD患儿比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明越小的患儿，感染CD的可能性越大，使用抗生素的时间和住院时间越长，其他的临床资料，包括白细胞数、中性粒细胞数、C反应蛋白值、抗生素联合应用情况和微生态制剂使用情况在CDAD与AAD之间没有明显区别。, 百拇医药(胡鸿伟 程国平 戴昕 等)