赣州市唇腭裂孕妇血浆代谢组学的初步分析(2)
1.3.2 样本预处理 室温下解冻样本，将EP管依次编号，分别在关内加入600 ?L样本液和300 ?L重水，以快速涡旋混匀器震荡混匀30 s后静置10 min，在4 ℃温度下以14 000 r/min转速离心5 min，取上清液500 ?L加入直径为5 mm核磁共振管中，待NMR分析。
1.3.3 图谱和数据处理与获得 采用NMR方法分析，测量仪器采用INOVA-400MHZ型超导核磁共振波谱仪，获得两组患者血浆一维1H NMR谱图。在室温条件下，在NMR波谱仪上调整Presat脉冲序列，调整脉冲为45。，用预饱和方式抑制水峰，调整观测频率为399.89 Hz，弛豫时间为1 s，预饱和时间为2 s，谱宽5218.2 Hz，采样点数64 k，采样时间为3.744 s，叠加次数128次，仪器的分辨率为0.45 Hz，灵敏度为450∶1，预饱和频率和中心频率为水峰位置。获取样本的波谱图，即原始自由感应衰减信号数据。将所有样本的NMR数据导入MESTRE-v4.7软件中进行分析，调节FID信号32 k傅立叶变换后，获取1H NMR图谱。将定位TMS峰为δ0.00，对所获图谱进行基线和相位校正后，确定NMR谱化学位移，对δ0～4.52、δ6～10区域谱峰者，每段按照Δ6=0.04 ppm将谱图分解成212个区域，后进行分段积分，获得各个化学位移值段所对应积分值。光谱采集所有样本，获得血浆数据，并将其构成n x d二维矩阵。将积分数据统一后，用Excel或文本方式储存。采用SIMCA-P11.0软件对PCA进行分析，求出主成分，血浆的代谢组成分采用PC进行分析。所得分析结果使用载荷图和得分图表示。载荷图反映所有积分段对样本主成分得分值贡献，与得分图进行结合分析获得组间分布差异，并分析出此差异对积分段贡献；结合1H NMR谱图与所对应化学位移值进行对应后即可确定相应的代谢物，从而分析出样品中某些代谢物的变化和其可能意义。得分图通常采用各样本在前2个主成分坐标系中的值来表示，反映样本之间的分布关系，从中可以得出各组样本之间的差异。通过对OPLS-DA进行分析，得出所有代谢物相应的相关系数，将有统计意义代谢物统一进行归纳。在相关系数图中，将每一个变量的标准偏差的平方根值与loading值相乘后对数据进行回溯转换。将转化结果与相应相关系数临界值表进行对比，获得引起组间差异的代谢物。
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2 结果
2.1 两组血浆1H NMR图谱对照比较 将唇腭裂胎儿孕妇和正常胎儿孕妇血浆1H NMR核磁代谢图谱放大16倍并进行叠加比较，波谱显示两组样品在δ0.5～5.5和δ5.5～9.0的化学位移处存在差异波峰，见图1。
2.2 主成分分析 为分析各血浆样本间关系，将校正后的数据做PCA分析。PCA是可以将分散在一组变量上的代谢图谱信息集中到某几个综合指标上的统计分析方法，利用主成分分析机体代谢的变化特征。采用SIMCA-P+软件(V11.0， Umetrics AB， Umea， Sweden)对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，PCA采用中心化换算(mean center scaling，Ctr)的数据标度换算方式，见图2。
2.3 组间差异代谢物统计 病例组患者血浆中苯丙氨酸、缬氨酸和酪氨酸含量高于对照组，而丙氨酸、胆碱、磷酰胆碱代谢产物较对照组含量降低，见表1。
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3 讨论
唇腭裂为先天性发育畸形疾病，为母体及胎儿在受到多种影响因素下引起的发育畸形，对胎儿正常生长发育、生活、学习有重要影响。唇腭裂患儿出生后对其语言、听觉、外观及心理造成严重影响，可对健康、社会融合造成长期不良后果[6-8]。在妊娠过程中及时发现唇腭裂胎儿，早期进行干预可降低唇腭裂出生率，对提高生育质量有重要帮助[9]。临床中寻找有效早期诊断标志至关重要，三维超声为目前临床中妊娠期诊断唇腭裂有效、经济、无创、便捷的辅助手段，常规在妊娠16～27周进行检查，通过直接观察胎儿发育状况判定是否患有唇腭裂[10]。但长期临床实践发现，超声在检查过程中胎儿位置变动、羊水过少、孕周过大或过小及超声操纵人员手法不一等多种因素均可影响获得胎儿面部满意三维容积图像，因此会造成误诊、漏诊或诊断不清[11]。
代谢组学为新兴技术是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢产物本身的改变或随时间的变化，来研究生物体系的代谢途径的一种技术[12]。与基因组学、转录组学和蛋白质组学相对应，代谢组学是一门对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析，以监测活细胞中化学变化的科学[13]。代谢组学通过对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定量或定性分析，检测机体体液、细胞提取物、细胞培养液及组织代谢物质变化，通过生物信息、化学计量学、统计学分析从而发现其内在联系，发现在特定疾病中代谢组学特征，从而获得诊断依据[14]。
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唇腭裂发生受母体遗传和环境影响，基于NMR代谢组学技术对生物液体检测可达到正常生理水平，获得具有特征代谢指纹图谱，通过对比分析特征性代谢组学，为整体研究母体代谢在畸形发生过程中的变化提供了有效手段[15]。有研究提示，先天性唇腭裂患者和正常人的血浆代谢存在差异，运用代谢组学技术可以早期筛查唇腭裂疾病并探讨其代谢机制，同时表明在此基础上推断其潜在的发病具有一定可行性[16-17]。本次研究将超声明确诊断为唇腭裂孕妇血浆代谢组学与正常孕妇进行对比分析，结果得出两者血浆代谢产物存在显著差异，病例组患者血浆中苯丙氨酸、缬氨酸和酪氨酸含量高于对照组，而丙氨酸、胆碱、酰胆碱代谢产物较对照组含量降低。这些差异特征代谢产物可能为唇腭裂胎儿生物学标记，为以后临床通过血浆代谢组学检测诊断唇腭裂提供有效依据。苯丙氨酸和缬氨酸均为人体必须氨基酸，缬氨酸可作用于黄体、乳房、卵巢，维持神经系统发挥正常作用。苯丙氨酸主要作用于人体神经中枢，确保神经、体液等各项调节正常。丙氨酸为人体非必须氨基酸，但在人体中发挥重要作用，可协助机体将葡萄糖转化为能量，同时还能协助人体肝脏对各种毒素进行清除，为机体提供大量能量。胆碱为有机碱，为卵磷脂合成主要成分，同时在神经鞘内广泛存在，为人体甲基产物组成成分，同时为乙酰胆碱前体。研究指出，胆碱可促进人体机体、大脑发育，具有调控细胞凋亡、完成信息传导、提高人体记忆力等功效[18]。唇腭裂患儿母体上述成分出现异常可能和疾病发生有一定相关性。有学者研究指出，在腭胚突发育过程中母体环境与胚胎环境是紧密相关的，胚胎代谢异常会引起母体代谢的异常变化，两者之间存在有互动的关系[19]。表明唇腭裂胎儿代谢与母体有特定相关性，通过检测孕妇血浆代谢组学，分析特有特征对临床诊断妊娠期唇腭裂疾病有重要意义。, http://www.100md.com(凌永昌等)
1.3.3 图谱和数据处理与获得 采用NMR方法分析，测量仪器采用INOVA-400MHZ型超导核磁共振波谱仪，获得两组患者血浆一维1H NMR谱图。在室温条件下，在NMR波谱仪上调整Presat脉冲序列，调整脉冲为45。，用预饱和方式抑制水峰，调整观测频率为399.89 Hz，弛豫时间为1 s，预饱和时间为2 s，谱宽5218.2 Hz，采样点数64 k，采样时间为3.744 s，叠加次数128次，仪器的分辨率为0.45 Hz，灵敏度为450∶1，预饱和频率和中心频率为水峰位置。获取样本的波谱图，即原始自由感应衰减信号数据。将所有样本的NMR数据导入MESTRE-v4.7软件中进行分析，调节FID信号32 k傅立叶变换后，获取1H NMR图谱。将定位TMS峰为δ0.00，对所获图谱进行基线和相位校正后，确定NMR谱化学位移，对δ0～4.52、δ6～10区域谱峰者，每段按照Δ6=0.04 ppm将谱图分解成212个区域，后进行分段积分，获得各个化学位移值段所对应积分值。光谱采集所有样本，获得血浆数据，并将其构成n x d二维矩阵。将积分数据统一后，用Excel或文本方式储存。采用SIMCA-P11.0软件对PCA进行分析，求出主成分，血浆的代谢组成分采用PC进行分析。所得分析结果使用载荷图和得分图表示。载荷图反映所有积分段对样本主成分得分值贡献，与得分图进行结合分析获得组间分布差异，并分析出此差异对积分段贡献；结合1H NMR谱图与所对应化学位移值进行对应后即可确定相应的代谢物，从而分析出样品中某些代谢物的变化和其可能意义。得分图通常采用各样本在前2个主成分坐标系中的值来表示，反映样本之间的分布关系，从中可以得出各组样本之间的差异。通过对OPLS-DA进行分析，得出所有代谢物相应的相关系数，将有统计意义代谢物统一进行归纳。在相关系数图中，将每一个变量的标准偏差的平方根值与loading值相乘后对数据进行回溯转换。将转化结果与相应相关系数临界值表进行对比，获得引起组间差异的代谢物。
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2 结果
2.1 两组血浆1H NMR图谱对照比较 将唇腭裂胎儿孕妇和正常胎儿孕妇血浆1H NMR核磁代谢图谱放大16倍并进行叠加比较，波谱显示两组样品在δ0.5～5.5和δ5.5～9.0的化学位移处存在差异波峰，见图1。
2.2 主成分分析 为分析各血浆样本间关系，将校正后的数据做PCA分析。PCA是可以将分散在一组变量上的代谢图谱信息集中到某几个综合指标上的统计分析方法，利用主成分分析机体代谢的变化特征。采用SIMCA-P+软件(V11.0， Umetrics AB， Umea， Sweden)对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，PCA采用中心化换算(mean center scaling，Ctr)的数据标度换算方式，见图2。
2.3 组间差异代谢物统计 病例组患者血浆中苯丙氨酸、缬氨酸和酪氨酸含量高于对照组，而丙氨酸、胆碱、磷酰胆碱代谢产物较对照组含量降低，见表1。
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3 讨论
唇腭裂为先天性发育畸形疾病，为母体及胎儿在受到多种影响因素下引起的发育畸形，对胎儿正常生长发育、生活、学习有重要影响。唇腭裂患儿出生后对其语言、听觉、外观及心理造成严重影响，可对健康、社会融合造成长期不良后果[6-8]。在妊娠过程中及时发现唇腭裂胎儿，早期进行干预可降低唇腭裂出生率，对提高生育质量有重要帮助[9]。临床中寻找有效早期诊断标志至关重要，三维超声为目前临床中妊娠期诊断唇腭裂有效、经济、无创、便捷的辅助手段，常规在妊娠16～27周进行检查，通过直接观察胎儿发育状况判定是否患有唇腭裂[10]。但长期临床实践发现，超声在检查过程中胎儿位置变动、羊水过少、孕周过大或过小及超声操纵人员手法不一等多种因素均可影响获得胎儿面部满意三维容积图像，因此会造成误诊、漏诊或诊断不清[11]。
代谢组学为新兴技术是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢产物本身的改变或随时间的变化，来研究生物体系的代谢途径的一种技术[12]。与基因组学、转录组学和蛋白质组学相对应，代谢组学是一门对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析，以监测活细胞中化学变化的科学[13]。代谢组学通过对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定量或定性分析，检测机体体液、细胞提取物、细胞培养液及组织代谢物质变化，通过生物信息、化学计量学、统计学分析从而发现其内在联系，发现在特定疾病中代谢组学特征，从而获得诊断依据[14]。
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唇腭裂发生受母体遗传和环境影响，基于NMR代谢组学技术对生物液体检测可达到正常生理水平，获得具有特征代谢指纹图谱，通过对比分析特征性代谢组学，为整体研究母体代谢在畸形发生过程中的变化提供了有效手段[15]。有研究提示，先天性唇腭裂患者和正常人的血浆代谢存在差异，运用代谢组学技术可以早期筛查唇腭裂疾病并探讨其代谢机制，同时表明在此基础上推断其潜在的发病具有一定可行性[16-17]。本次研究将超声明确诊断为唇腭裂孕妇血浆代谢组学与正常孕妇进行对比分析，结果得出两者血浆代谢产物存在显著差异，病例组患者血浆中苯丙氨酸、缬氨酸和酪氨酸含量高于对照组，而丙氨酸、胆碱、酰胆碱代谢产物较对照组含量降低。这些差异特征代谢产物可能为唇腭裂胎儿生物学标记，为以后临床通过血浆代谢组学检测诊断唇腭裂提供有效依据。苯丙氨酸和缬氨酸均为人体必须氨基酸，缬氨酸可作用于黄体、乳房、卵巢，维持神经系统发挥正常作用。苯丙氨酸主要作用于人体神经中枢，确保神经、体液等各项调节正常。丙氨酸为人体非必须氨基酸，但在人体中发挥重要作用，可协助机体将葡萄糖转化为能量，同时还能协助人体肝脏对各种毒素进行清除，为机体提供大量能量。胆碱为有机碱，为卵磷脂合成主要成分，同时在神经鞘内广泛存在，为人体甲基产物组成成分，同时为乙酰胆碱前体。研究指出，胆碱可促进人体机体、大脑发育，具有调控细胞凋亡、完成信息传导、提高人体记忆力等功效[18]。唇腭裂患儿母体上述成分出现异常可能和疾病发生有一定相关性。有学者研究指出，在腭胚突发育过程中母体环境与胚胎环境是紧密相关的，胚胎代谢异常会引起母体代谢的异常变化，两者之间存在有互动的关系[19]。表明唇腭裂胎儿代谢与母体有特定相关性，通过检测孕妇血浆代谢组学，分析特有特征对临床诊断妊娠期唇腭裂疾病有重要意义。, http://www.100md.com(凌永昌等)