IL—6和TNF—α在结肠癌患者血清中的测定及其意义(2)
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2013年8月-2014年5月本院外科诊断为结肠癌并行手术的患者39例作为研究对象(结肠癌组)，其中男18例，女21例，年龄41～75岁，平均(56.2±8.6)岁，均为原发性结肠腺癌患者，且经过肠镜活检、临床病理切片证实。根据Dukes分期(A期癌肿浸润深度限于直肠壁内，未穿出深肌层，且无淋巴结转移；B期癌肿侵犯浆膜层，亦可侵入浆膜外或肠外周围组织，但尚能整块切除，无淋巴结转移；C期癌肿侵犯肠壁全层或未侵犯全层，但伴有淋巴结转移；D期癌肿伴有远处器官转移、局部广泛浸润或淋巴结广泛转移不能根治性切除)进行分类，其中A+B期为20例，C+D期为19例。另选择39例于本院进行体检的正常人作为对照组，其中男20例，女19例，平均年龄(55.6±9.3)岁，均经过血常规、心电图、B超和X射线等检查，证实肝肾功能正常，无急、慢性感染性疾病，无重要脏器例如胃、肺、肝和心等疾病。两组年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者及健康对照者均签署知情同意书，研究经本院伦理委员会批准进行。
, 百拇医药
1.2 方法 对对照组、结肠癌组术前1 d和术后第7天的外周静脉血标本进行收集，分别装于真空EDTA抗凝管，3000 r/min离心5 min进行血浆分离，保存于-80 ℃。ELISA法检测IL-6与TNF-α细胞因子水平，检测试剂购于美国BPB生物有限公司。实验步骤按ELISA试剂盒说明书进行，标准品稀释好后加入反应孔内，然后加入待测标本，马上加入抗体(生物素标记)；盖好膜板，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育1 h；甩去孔内液体，然后加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复3次此操作；每孔加入亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育30 min；甩去孔内液体，重复洗涤3次；加入底物后轻轻振荡混匀，避光37 ℃孵育10 min；取出酶标板，迅速加入终止液，于450 nm波长下测定每孔OD值。
1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
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2.1 两组细胞因子血清浓度比较 结肠癌组血清中TNF-α浓度明显低于对照组，而IL-6浓度则高于对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
2.2 结肠癌组不同分期血清细胞因子浓度比较 Dukes A+B期TNF-α及IL-6浓度均低于Dukes C+D期，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3 结肠癌组手术前后血清细胞因子浓度比较 术后TNF-α浓度高于术前，比较差异有统计学意义(P<0.05)；IL-6浓度低于术前，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。
3 讨论
结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，是导致全球癌症死亡的最主要因素之一。其中40～50岁年龄段为高发病率阶段，其发病率位居我国恶性肿瘤第3位，且有逐年上升的趋势。各种细胞因子在机体内组成一个复杂、完整的网络体系，他们之间具有协同或相互抑制的作用，而他们之间平衡的打破现被认为是恶性肿瘤生长、转移、浸润过程中必要的重要条件之一[6-7]。其中，IL-6和TNF-α是重要的免疫细胞因子，其在肿瘤中的重要作用已有诸多研究证明。
, http://www.100md.com
IL-6是一种炎性细胞因子，其在各种恶性肿瘤的发生、发展和预后中均具有重要作用[8]。一般认为IL-6是由所接触的肿瘤细胞分泌而来，例如Chen等[9]的研究表明肿瘤细胞能够分泌IL-6。IL-6不单参与肿瘤的形成发展，而且具有促进细胞增殖的功能[10-12]。由本研究结果可见，结肠癌患者血清中IL-6水平高于正常人，与前期结果相一致[13]。在结肠肠癌患者中，IL-6血清水平随着肿瘤Dukes分期的进展而增加，不过在不同研究中其差异的统计学意义存在差异。本研究发现血清IL-6水平与肿瘤分期具有正相关性，且恶性程度越高，IL-6水平越高，这表明结肠癌患者和正常人的免疫状态明显存在差异，而免疫状态的异常往往利于肿瘤的发生发展。针对血清IL-6水平与患者术后生存情况间联系的少量研究表明，IL-6术前水平较高的患者其术后生存情况较不乐观，不过目前关于此研究的课题和样本量均不多[14]。例如Belluco等[15]针对208个临床病例样本的分析发现，IL-6在血清中水平<10 pg/mL时，患者的5年生存率为83%，而>10 pg/mL时患者的5年生存率降为56%，两者比较差异具有统计学意义(P=0.001)；因此，他们认为血清中IL-6水平>10 pg/mL可能是影响结肠癌预后的独立因素(relative risk=1.82，P=0.02)。因此，较高水平的IL-6有可能表明恶性肿瘤患者的病情开始出现恶化，对于患者的预后评估具有一定程度的帮助。有研究指出，加入IL-6(10 ng/mL)到培养中的SW-480细胞时，可见软琼脂细胞集落明显增加，且肿瘤细胞的趋化和对基底膜的浸润能力明显增强，这均说明IL-6对结直肠癌的发生发展具有关键作用[16]。Yuan等[17]针对结肠癌RKO和228细胞的研究发现，IL-6通过增加BCL-xL的表达从而阻止了Fas介导的凋亡。因此，IL-6信号途径在结直肠癌中的作用为今后的化学抗癌和治疗提供了新的靶点。
, 百拇医药
TNF-α也是一种重要的细胞因子，其与恶性肿瘤的关系密切，单核-巨噬细胞系统是其主要分泌来源，不过近年来的研究发现肿瘤细胞也可以表达。它除了参与机体的免疫反应外，还在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色，对肿瘤的发展转移具有重要作用[18]。目前，越来越多的研究发现实体瘤细胞质中出现TNF-α表达[19-20]。Volland等[21]应用原位杂交方法对肿瘤细胞进行检测，结果发现肿瘤细胞可自分泌产生TNF-α，同时认为所分泌的TNF-α具有促进肿瘤细胞生长和肿瘤浸润的作用。而TNF-α作为一种多功能的细胞因子，已有研究证实其在结肠癌浸润过程中占有重要的地位[18]。不过，TNF-α与肿瘤的生物学行为之间的关系存在争论较多，因为TNF-α的生物学功能具有双重性，它不单具有机体免疫保护的重要功能，同时也在机体的免疫病理损伤中发挥作用[22]。本研究结果表明，结肠癌患者术前TNF-α血清浓度低于对照组；手术切除肿瘤后，TNF-α水平有所恢复，这表明在荷瘤状态下，吞噬细胞功能可能下降，从而导致TNF-α分泌减少，说明癌组织的存在能影响机体的免疫水平，而免疫状态的改善有利于肿瘤治疗康复。而手术切除肿瘤后，相关的肿瘤抑制因子和封闭因子清除，使得吞噬细胞的功能逐渐恢复，从而使TNF-α水平有所上升。Utaisincharoen等[23]的体外实验进一步证实，TNF-α不但能抑制肿瘤细胞的增殖，同时能诱导肿瘤细胞凋亡。因此，TNF-α在结肠癌中表达降低，表明TNF-α在结肠癌中可能发挥抗肿瘤作用，其表达下调利于结肠癌的发生发展；而术后TNF-α的表达上调，更加表明其免疫保护的作用，其表达上调利于术后的康复。, 百拇医药(廖德贵 王珊 周春辉 黄世章 赖妙玲)
1.1 一般资料 选择2013年8月-2014年5月本院外科诊断为结肠癌并行手术的患者39例作为研究对象(结肠癌组)，其中男18例，女21例，年龄41～75岁，平均(56.2±8.6)岁，均为原发性结肠腺癌患者，且经过肠镜活检、临床病理切片证实。根据Dukes分期(A期癌肿浸润深度限于直肠壁内，未穿出深肌层，且无淋巴结转移；B期癌肿侵犯浆膜层，亦可侵入浆膜外或肠外周围组织，但尚能整块切除，无淋巴结转移；C期癌肿侵犯肠壁全层或未侵犯全层，但伴有淋巴结转移；D期癌肿伴有远处器官转移、局部广泛浸润或淋巴结广泛转移不能根治性切除)进行分类，其中A+B期为20例，C+D期为19例。另选择39例于本院进行体检的正常人作为对照组，其中男20例，女19例，平均年龄(55.6±9.3)岁，均经过血常规、心电图、B超和X射线等检查，证实肝肾功能正常，无急、慢性感染性疾病，无重要脏器例如胃、肺、肝和心等疾病。两组年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者及健康对照者均签署知情同意书，研究经本院伦理委员会批准进行。
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1.2 方法 对对照组、结肠癌组术前1 d和术后第7天的外周静脉血标本进行收集，分别装于真空EDTA抗凝管，3000 r/min离心5 min进行血浆分离，保存于-80 ℃。ELISA法检测IL-6与TNF-α细胞因子水平，检测试剂购于美国BPB生物有限公司。实验步骤按ELISA试剂盒说明书进行，标准品稀释好后加入反应孔内，然后加入待测标本，马上加入抗体(生物素标记)；盖好膜板，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育1 h；甩去孔内液体，然后加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复3次此操作；每孔加入亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育30 min；甩去孔内液体，重复洗涤3次；加入底物后轻轻振荡混匀，避光37 ℃孵育10 min；取出酶标板，迅速加入终止液，于450 nm波长下测定每孔OD值。
1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
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2.1 两组细胞因子血清浓度比较 结肠癌组血清中TNF-α浓度明显低于对照组，而IL-6浓度则高于对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
2.2 结肠癌组不同分期血清细胞因子浓度比较 Dukes A+B期TNF-α及IL-6浓度均低于Dukes C+D期，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3 结肠癌组手术前后血清细胞因子浓度比较 术后TNF-α浓度高于术前，比较差异有统计学意义(P<0.05)；IL-6浓度低于术前，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。
3 讨论
结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，是导致全球癌症死亡的最主要因素之一。其中40～50岁年龄段为高发病率阶段，其发病率位居我国恶性肿瘤第3位，且有逐年上升的趋势。各种细胞因子在机体内组成一个复杂、完整的网络体系，他们之间具有协同或相互抑制的作用，而他们之间平衡的打破现被认为是恶性肿瘤生长、转移、浸润过程中必要的重要条件之一[6-7]。其中，IL-6和TNF-α是重要的免疫细胞因子，其在肿瘤中的重要作用已有诸多研究证明。
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IL-6是一种炎性细胞因子，其在各种恶性肿瘤的发生、发展和预后中均具有重要作用[8]。一般认为IL-6是由所接触的肿瘤细胞分泌而来，例如Chen等[9]的研究表明肿瘤细胞能够分泌IL-6。IL-6不单参与肿瘤的形成发展，而且具有促进细胞增殖的功能[10-12]。由本研究结果可见，结肠癌患者血清中IL-6水平高于正常人，与前期结果相一致[13]。在结肠肠癌患者中，IL-6血清水平随着肿瘤Dukes分期的进展而增加，不过在不同研究中其差异的统计学意义存在差异。本研究发现血清IL-6水平与肿瘤分期具有正相关性，且恶性程度越高，IL-6水平越高，这表明结肠癌患者和正常人的免疫状态明显存在差异，而免疫状态的异常往往利于肿瘤的发生发展。针对血清IL-6水平与患者术后生存情况间联系的少量研究表明，IL-6术前水平较高的患者其术后生存情况较不乐观，不过目前关于此研究的课题和样本量均不多[14]。例如Belluco等[15]针对208个临床病例样本的分析发现，IL-6在血清中水平<10 pg/mL时，患者的5年生存率为83%，而>10 pg/mL时患者的5年生存率降为56%，两者比较差异具有统计学意义(P=0.001)；因此，他们认为血清中IL-6水平>10 pg/mL可能是影响结肠癌预后的独立因素(relative risk=1.82，P=0.02)。因此，较高水平的IL-6有可能表明恶性肿瘤患者的病情开始出现恶化，对于患者的预后评估具有一定程度的帮助。有研究指出，加入IL-6(10 ng/mL)到培养中的SW-480细胞时，可见软琼脂细胞集落明显增加，且肿瘤细胞的趋化和对基底膜的浸润能力明显增强，这均说明IL-6对结直肠癌的发生发展具有关键作用[16]。Yuan等[17]针对结肠癌RKO和228细胞的研究发现，IL-6通过增加BCL-xL的表达从而阻止了Fas介导的凋亡。因此，IL-6信号途径在结直肠癌中的作用为今后的化学抗癌和治疗提供了新的靶点。
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TNF-α也是一种重要的细胞因子，其与恶性肿瘤的关系密切，单核-巨噬细胞系统是其主要分泌来源，不过近年来的研究发现肿瘤细胞也可以表达。它除了参与机体的免疫反应外，还在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色，对肿瘤的发展转移具有重要作用[18]。目前，越来越多的研究发现实体瘤细胞质中出现TNF-α表达[19-20]。Volland等[21]应用原位杂交方法对肿瘤细胞进行检测，结果发现肿瘤细胞可自分泌产生TNF-α，同时认为所分泌的TNF-α具有促进肿瘤细胞生长和肿瘤浸润的作用。而TNF-α作为一种多功能的细胞因子，已有研究证实其在结肠癌浸润过程中占有重要的地位[18]。不过，TNF-α与肿瘤的生物学行为之间的关系存在争论较多，因为TNF-α的生物学功能具有双重性，它不单具有机体免疫保护的重要功能，同时也在机体的免疫病理损伤中发挥作用[22]。本研究结果表明，结肠癌患者术前TNF-α血清浓度低于对照组；手术切除肿瘤后，TNF-α水平有所恢复，这表明在荷瘤状态下，吞噬细胞功能可能下降，从而导致TNF-α分泌减少，说明癌组织的存在能影响机体的免疫水平，而免疫状态的改善有利于肿瘤治疗康复。而手术切除肿瘤后，相关的肿瘤抑制因子和封闭因子清除，使得吞噬细胞的功能逐渐恢复，从而使TNF-α水平有所上升。Utaisincharoen等[23]的体外实验进一步证实，TNF-α不但能抑制肿瘤细胞的增殖，同时能诱导肿瘤细胞凋亡。因此，TNF-α在结肠癌中表达降低，表明TNF-α在结肠癌中可能发挥抗肿瘤作用，其表达下调利于结肠癌的发生发展；而术后TNF-α的表达上调，更加表明其免疫保护的作用，其表达上调利于术后的康复。, 百拇医药(廖德贵 王珊 周春辉 黄世章 赖妙玲)