吸入氢气对脓毒症大鼠心肌损伤的影响(2)
【Key words】 Hydrogen； Sepsis； Myocardial injury
First-author’s address：Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.32.005
严重脓毒症是一种严重的全身性炎症反应，可在短时间内发展为多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至死亡，它是重症医学中的难点，其中心肌损伤是脓毒症最常见的并发症，严重影响着患者的预后。因此，早期有效的预防治疗脓毒症患者的心肌损伤成为治疗的重要部分[1-2]。氢气是一种还原性的惰性气体，最近研究发现氢气的还原性在治疗急性损伤中心肌缺血再灌注损伤有特殊的作用[3]。但其对脓毒症心肌损伤的作用不明，本研究探讨吸入氢气对脓毒症心肌损伤的影响，为临床上治疗脓毒症心肌损伤提供新的思路。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选择日龄80～90 d雄性SD大鼠48只，体重(220±25)g，购于青岛大学医学院实验中心，通过随机数字法分为4组，每组各12只：假手术组(SH组)、脓毒症组(CLP组)、1%氢气组(1%H2组)，2%氢气组(2%H2组)。SH组作为假手术组，CLP组为脓毒症无治疗组，1%氢气组分别在CLP术后1、6 h吸入1%氢气1 h，2%氢气组分别在CLP术后1、6 h吸入2%氢气1 h。
1.2 动物模型制作 参照文献[4]采用盲肠结扎并穿刺法制作脓毒症大鼠模型，SH组不结扎穿刺盲肠，其他操作与CLP组相同。所有大鼠腹腔注射浓度20%的乌拉坦(0.5 mL/100 g)麻醉后固定于动物手术台上，在腹部正中作长约3 cm的切口，探查并游离出盲肠，在距盲肠根部1 cm处用3-0丝线结扎盲肠，结扎过程勿结扎到肠系膜血管及回肠。在盲肠的肠壁的浆膜面上用18号针穿刺3次，相距0.5 cm/针，以轻轻挤压肠管有粪便从穿刺孔中流出为准，肠管仔细还纳回腹腔并关腹。参照文献[5]的方法，使用M177021氢气发生器(北京中西远大公司)，通过电解水产生氢气，氢气纯度约为99.999%。将大鼠放入带有入气口和出气口的密闭箱子，将氢气和氧气通过入气口输入箱子里，并在出气口收集残气。使用泵吸式JSA8-H2高敏氢气检测仪(深圳吉顺安科技有限公司)监测出气口H2的浓度并调节到氢气到相应的浓度。1%H2组和2%H2组分别在CLP术后1、6 h吸入相应浓度的氢气1 h，其他组进行相应的操作但不吸入氢气。
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1.3 方法 各组大鼠均在造模成功后24 h处死，处死前用20%的乌拉坦麻醉，通过腹主动脉采集血液标本，离心后取上清液，用酶联免疫吸附(ELISE)法测定血清中cTnI和BNP的浓度，操作严格参考试剂盒说明书(试剂盒购买于美国R&D公司)。处死大鼠后立即分离左心室，用冷生理盐水将左心室的血迹冲洗干净，取心尖处的少量心肌，用甲醛固定后进行HE染色，参照文献[6]在光镜下观察心肌组织计算病理积分。在光镜下随机观察10个视野，观察并计算每个视野中心肌组织的炎症细胞的浸润、坏死及水肿面积与整个视野面积的比例；正常心肌计0分，<1/4计1分，1/4～1/2计2分，1/2～3/4计3分，>3/4计4分，最后计算10个视野评分算平均值。剩余的心肌组织取约1 g加入4 ℃预冷的生理盐水中，制作组织匀浆并保存于-70 ℃中。用ELISE法测定ET-1、TNF-α、IL-6的蛋白表达水平，操作严格按照试剂盒说明书(试剂盒购买于美国R&D公司)。采用硝酸还原酶法测定大鼠心肌组织中NO的含量(试剂盒购买于南京建成科技有限公司)，操作严格按照试剂盒说明书。
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1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料采用(x±s)表示，组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组血清cTnI、BNP和心肌病理评分的比较 与SH组相比，其他各组大鼠血清cTnI、BNP表达水平及心肌病理评分均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与CLP组相比，l%H2组和2%H2组的cTnI、BNP的表达水平及心肌病理评分明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；而l%H2组和2%H2组的血清cTnI、BNP和心肌病理评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.2 各组大鼠心肌ET-1和NO的比较 与SH组相比，其他各组大鼠心肌ET-1表达水平明显升高，而NO表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与CLP组相比，1%H2组和2%H2组的大鼠心肌ET-1表达水平明显下降，而NO表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；但1%H2组和2%H2组的组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
, 百拇医药
2.3 各组心肌组织中TNF-α和IL-6的比较 与SH组相比，其他各组大鼠血清TNF-α和IL-6表达水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与CLP组比较，各组的TNF-α和IL-6的表达水平均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；而1%H2组和2%H2组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。
3 讨论
脓毒症是由严重感染、创伤引起的全身炎症性反应，是ICU中非心脏患者的常见死亡原因之一。在脓毒症早期即常伴有不同程度的心肌损伤，表现为心力衰竭、低血压、心律失常等，可导致其他器官的损伤。因此，脓毒症心肌损伤的早期诊断与治疗变的十分重要[7]。本研究采用CLP法制备的大鼠脓毒症心肌损伤模型，它的机制是通过大鼠盲肠的结扎和穿孔，使肠内容物细菌进入污染腹腔，造成大鼠的弥漫性腹膜炎，诱发全身性破坏性炎症反应的发生，与脂多糖(LPS)诱导的脓毒症相比具有更好的临床相关性，在动物实验中广泛使用[4]。, 百拇医药(张聪聪 巩霞 王滨 朱建昌 陈欣欣 张泉三)
First-author’s address：Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.32.005
严重脓毒症是一种严重的全身性炎症反应，可在短时间内发展为多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至死亡，它是重症医学中的难点，其中心肌损伤是脓毒症最常见的并发症，严重影响着患者的预后。因此，早期有效的预防治疗脓毒症患者的心肌损伤成为治疗的重要部分[1-2]。氢气是一种还原性的惰性气体，最近研究发现氢气的还原性在治疗急性损伤中心肌缺血再灌注损伤有特殊的作用[3]。但其对脓毒症心肌损伤的作用不明，本研究探讨吸入氢气对脓毒症心肌损伤的影响，为临床上治疗脓毒症心肌损伤提供新的思路。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选择日龄80～90 d雄性SD大鼠48只，体重(220±25)g，购于青岛大学医学院实验中心，通过随机数字法分为4组，每组各12只：假手术组(SH组)、脓毒症组(CLP组)、1%氢气组(1%H2组)，2%氢气组(2%H2组)。SH组作为假手术组，CLP组为脓毒症无治疗组，1%氢气组分别在CLP术后1、6 h吸入1%氢气1 h，2%氢气组分别在CLP术后1、6 h吸入2%氢气1 h。
1.2 动物模型制作 参照文献[4]采用盲肠结扎并穿刺法制作脓毒症大鼠模型，SH组不结扎穿刺盲肠，其他操作与CLP组相同。所有大鼠腹腔注射浓度20%的乌拉坦(0.5 mL/100 g)麻醉后固定于动物手术台上，在腹部正中作长约3 cm的切口，探查并游离出盲肠，在距盲肠根部1 cm处用3-0丝线结扎盲肠，结扎过程勿结扎到肠系膜血管及回肠。在盲肠的肠壁的浆膜面上用18号针穿刺3次，相距0.5 cm/针，以轻轻挤压肠管有粪便从穿刺孔中流出为准，肠管仔细还纳回腹腔并关腹。参照文献[5]的方法，使用M177021氢气发生器(北京中西远大公司)，通过电解水产生氢气，氢气纯度约为99.999%。将大鼠放入带有入气口和出气口的密闭箱子，将氢气和氧气通过入气口输入箱子里，并在出气口收集残气。使用泵吸式JSA8-H2高敏氢气检测仪(深圳吉顺安科技有限公司)监测出气口H2的浓度并调节到氢气到相应的浓度。1%H2组和2%H2组分别在CLP术后1、6 h吸入相应浓度的氢气1 h，其他组进行相应的操作但不吸入氢气。
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1.3 方法 各组大鼠均在造模成功后24 h处死，处死前用20%的乌拉坦麻醉，通过腹主动脉采集血液标本，离心后取上清液，用酶联免疫吸附(ELISE)法测定血清中cTnI和BNP的浓度，操作严格参考试剂盒说明书(试剂盒购买于美国R&D公司)。处死大鼠后立即分离左心室，用冷生理盐水将左心室的血迹冲洗干净，取心尖处的少量心肌，用甲醛固定后进行HE染色，参照文献[6]在光镜下观察心肌组织计算病理积分。在光镜下随机观察10个视野，观察并计算每个视野中心肌组织的炎症细胞的浸润、坏死及水肿面积与整个视野面积的比例；正常心肌计0分，<1/4计1分，1/4～1/2计2分，1/2～3/4计3分，>3/4计4分，最后计算10个视野评分算平均值。剩余的心肌组织取约1 g加入4 ℃预冷的生理盐水中，制作组织匀浆并保存于-70 ℃中。用ELISE法测定ET-1、TNF-α、IL-6的蛋白表达水平，操作严格按照试剂盒说明书(试剂盒购买于美国R&D公司)。采用硝酸还原酶法测定大鼠心肌组织中NO的含量(试剂盒购买于南京建成科技有限公司)，操作严格按照试剂盒说明书。
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1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料采用(x±s)表示，组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组血清cTnI、BNP和心肌病理评分的比较 与SH组相比，其他各组大鼠血清cTnI、BNP表达水平及心肌病理评分均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与CLP组相比，l%H2组和2%H2组的cTnI、BNP的表达水平及心肌病理评分明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；而l%H2组和2%H2组的血清cTnI、BNP和心肌病理评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.2 各组大鼠心肌ET-1和NO的比较 与SH组相比，其他各组大鼠心肌ET-1表达水平明显升高，而NO表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与CLP组相比，1%H2组和2%H2组的大鼠心肌ET-1表达水平明显下降，而NO表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；但1%H2组和2%H2组的组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
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2.3 各组心肌组织中TNF-α和IL-6的比较 与SH组相比，其他各组大鼠血清TNF-α和IL-6表达水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与CLP组比较，各组的TNF-α和IL-6的表达水平均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；而1%H2组和2%H2组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。
3 讨论
脓毒症是由严重感染、创伤引起的全身炎症性反应，是ICU中非心脏患者的常见死亡原因之一。在脓毒症早期即常伴有不同程度的心肌损伤，表现为心力衰竭、低血压、心律失常等，可导致其他器官的损伤。因此，脓毒症心肌损伤的早期诊断与治疗变的十分重要[7]。本研究采用CLP法制备的大鼠脓毒症心肌损伤模型，它的机制是通过大鼠盲肠的结扎和穿孔，使肠内容物细菌进入污染腹腔，造成大鼠的弥漫性腹膜炎，诱发全身性破坏性炎症反应的发生，与脂多糖(LPS)诱导的脓毒症相比具有更好的临床相关性，在动物实验中广泛使用[4]。, 百拇医药(张聪聪 巩霞 王滨 朱建昌 陈欣欣 张泉三)