肿瘤细胞特异启动子hTERT介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR的研究(3)
MT2-r5’-CGCGGATCCGCGGAATACAGTGAGTACTTGTCC-3’
1.2.3 荧光素酶活性检测 在24孔培养板中每孔铺入2×105个细胞，12 h后换液，将携带待检测启动子-luc报告基因表达元件的质粒用脂质体对细胞进行转染，质粒用量为0.6 μg。转染后48 h裂解细胞，检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。检测试剂为Promega公司产品Dual-Luciferase?双萤光素酶报告基因检测系统，检测过程参照说明书进行。
1.2.4 流式细胞术检测转染后细胞中P-gp蛋白的表达 转染48 h后消化细胞制成细胞悬液，收集约1×106个细胞，1000 r/min离心3 min，预冷的PBS洗1次。用1 mL含5%血清的PBS重新悬浮细胞，4 ℃孵育10 min，1000 r/min离心3 min去上清。加入含5%Phycoerythrin(PE) anti-human MDR1的PBS 100 μL，4 ℃避光孵育60 min，离心弃上清。用PBS洗涤2次，加入1 mL PBS重悬细胞。使用EPICS XL流式细胞仪进行检测，数据应用CellQuest软件进行分析。
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1.2.5 RT-PCR方法检测细胞中mdr1基因的mRNA水平 细胞经消化后，用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录获得cDNA。以cDNA为模板进行PCR检测，以细胞看家基因GADPH为对照。mdr1的PCR扩增引物序列为：mdr1f：5’-ATGTAAGGTTTCTACGGGA-3’；mdr1r：5’-ATCCACGGACACTCCTACG-3’。PCR反应条件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 50 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30个循环，72 ℃ 10 min。取3 μL PCR.产物行1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并进行扫描分析，重复检测3次。
1.2.6 CCK8 kit检测转染后细胞紫杉醇药物半数致死量(IC50)[7] 预先在24孔板上进行共转染实验(具体方法同前)，36 h后将24孔板上的细胞消化并重新铺到96孔板，细胞数量为5000个/孔。
12 h后分别加入不同浓度的紫杉醇(分别为32 000、8000、2000、500、125、32、8、2、0 ng/mL)，孵育24 h后再加入10 μL CCK8溶液，37 ℃ 5% CO2孵育3 h，检测OD450/OD620值。根据寇氏改良公式：抑制率=(未处理细胞的OD值-处理后细胞的OD值)/未处理细胞的OD值[7]。计算不同浓度的紫杉醇的抑制率，并利用IC50计算软件计算出药物的IC50。
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2 结果
2.1 hTERT启动子在卵巢癌细胞的表达活性 hTERT启动子在卵巢癌细胞A2780可有效启动luc报告基因的表达，而在人二倍体细胞MRC-5中没有显示出表达活性，见图1。
图1 不同细胞hTERT启动子转录活性比较
2.2 hTERT启动子介导的靶向mdr1的siRNA的表达载体构建 本研究构建的hTERT启动子介导的siMDR1B可获得良好的抑制效果，可有效抑制pSTluc-MT2的表达，体现出良好的抑制特异性，见图2。
图2 hTERT启动子引导的靶向mdr1的siRNA的抑制效率
2.3 hTERT启动子介导的siMDR1B对mdr1基因转录与表达的抑制效果 phTERT-siMDR1B转染细胞的mdr1的mRNA水平低于对照组细胞，说明了hTERT启动子介导的siMDR1B表达可有效抑制靶基因mdr1的mRNA水平；与转染对照组细胞相比，转染phTERT-siMDR1B细胞中的P-gp蛋白活性明显降低，与转染对照组细胞比对P-gp蛋白的抑制效率为65.5%，hTERT启动子介导的siMDR1B对mdr1基因表达具有较好的抑制效果。见图3。
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图3 siMDR1B在转染后细胞中对mdr1基因mRNA水平及蛋白水平的抑制效果
注：A：mdr1基因mRNA水平，1、2-siMDR1B，3、4-vector-control，5、6-agent-control，7-siB245，8-mark，9-cell-control；B：P-gp水平
2.4 hTERT启动子介导的siMDR1B逆转卵巢癌细胞MDR 与对照组相比转染了hTERT启动子介导的siMDR1B表达元件的细胞对紫杉醇的耐药程度显著降低，hTERT启动子介导的siMDR1B能够用于卵巢癌细胞的MDR逆转。见图4。
图4 hTERT启动子介导的siMDR1B对紫杉醇的耐药程度
3 讨论
紫杉醇是卵巢肿瘤化疗常用药之一，肿瘤细胞对包括紫杉醇在内的治疗药物产生多药耐药(MDR)是导致对肿瘤化疗失败的重要原因。研究显示，肿瘤细胞中mdr1基因编码的P-gp蛋白过表达与MDR产生密切相关[8]。通过抑制肿瘤细胞中mdr1基因的表达可实现肿瘤细胞的耐药逆转[9]。RNAi技术可用于特异、高效地抑制细胞内靶基因的表达，在抑制mdr1基因以及MDR逆转研究中具有良好的应用潜力。已有研究显示，靶向mdr1基因的siRNA可抑制骨肉瘤、肾癌、肺癌、肝癌、卵巢癌细胞中的mdr1表达并逆转耐药[10-12]。然而在RNAi抗肿瘤研究中，实现siRNA对肿瘤组织细胞的特异性导入或表达是十分重要的，特别是以在一些正常组织细胞中也有表达的mdr1基因作为抑制靶标时。本研究构建了肿瘤细胞特异性启动子hTERT引导的靶向mdr1基因的siRNA表达元件，并证明其可在卵巢癌细胞中特异表达并有效抑制mdr1基因，并可逆转卵巢癌细胞对紫杉醇药物的耐药，为进一步应用RNAi技术开展卵巢癌MDR逆转研究提供了重要基础。, http://www.100md.com(林燕真 程通 张雅丽 李瑞银 杨连威 温兰玲)
1.2.3 荧光素酶活性检测 在24孔培养板中每孔铺入2×105个细胞，12 h后换液，将携带待检测启动子-luc报告基因表达元件的质粒用脂质体对细胞进行转染，质粒用量为0.6 μg。转染后48 h裂解细胞，检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。检测试剂为Promega公司产品Dual-Luciferase?双萤光素酶报告基因检测系统，检测过程参照说明书进行。
1.2.4 流式细胞术检测转染后细胞中P-gp蛋白的表达 转染48 h后消化细胞制成细胞悬液，收集约1×106个细胞，1000 r/min离心3 min，预冷的PBS洗1次。用1 mL含5%血清的PBS重新悬浮细胞，4 ℃孵育10 min，1000 r/min离心3 min去上清。加入含5%Phycoerythrin(PE) anti-human MDR1的PBS 100 μL，4 ℃避光孵育60 min，离心弃上清。用PBS洗涤2次，加入1 mL PBS重悬细胞。使用EPICS XL流式细胞仪进行检测，数据应用CellQuest软件进行分析。
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1.2.5 RT-PCR方法检测细胞中mdr1基因的mRNA水平 细胞经消化后，用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录获得cDNA。以cDNA为模板进行PCR检测，以细胞看家基因GADPH为对照。mdr1的PCR扩增引物序列为：mdr1f：5’-ATGTAAGGTTTCTACGGGA-3’；mdr1r：5’-ATCCACGGACACTCCTACG-3’。PCR反应条件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 50 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30个循环，72 ℃ 10 min。取3 μL PCR.产物行1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并进行扫描分析，重复检测3次。
1.2.6 CCK8 kit检测转染后细胞紫杉醇药物半数致死量(IC50)[7] 预先在24孔板上进行共转染实验(具体方法同前)，36 h后将24孔板上的细胞消化并重新铺到96孔板，细胞数量为5000个/孔。
12 h后分别加入不同浓度的紫杉醇(分别为32 000、8000、2000、500、125、32、8、2、0 ng/mL)，孵育24 h后再加入10 μL CCK8溶液，37 ℃ 5% CO2孵育3 h，检测OD450/OD620值。根据寇氏改良公式：抑制率=(未处理细胞的OD值-处理后细胞的OD值)/未处理细胞的OD值[7]。计算不同浓度的紫杉醇的抑制率，并利用IC50计算软件计算出药物的IC50。
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2 结果
2.1 hTERT启动子在卵巢癌细胞的表达活性 hTERT启动子在卵巢癌细胞A2780可有效启动luc报告基因的表达，而在人二倍体细胞MRC-5中没有显示出表达活性，见图1。
图1 不同细胞hTERT启动子转录活性比较
2.2 hTERT启动子介导的靶向mdr1的siRNA的表达载体构建 本研究构建的hTERT启动子介导的siMDR1B可获得良好的抑制效果，可有效抑制pSTluc-MT2的表达，体现出良好的抑制特异性，见图2。
图2 hTERT启动子引导的靶向mdr1的siRNA的抑制效率
2.3 hTERT启动子介导的siMDR1B对mdr1基因转录与表达的抑制效果 phTERT-siMDR1B转染细胞的mdr1的mRNA水平低于对照组细胞，说明了hTERT启动子介导的siMDR1B表达可有效抑制靶基因mdr1的mRNA水平；与转染对照组细胞相比，转染phTERT-siMDR1B细胞中的P-gp蛋白活性明显降低，与转染对照组细胞比对P-gp蛋白的抑制效率为65.5%，hTERT启动子介导的siMDR1B对mdr1基因表达具有较好的抑制效果。见图3。
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图3 siMDR1B在转染后细胞中对mdr1基因mRNA水平及蛋白水平的抑制效果
注：A：mdr1基因mRNA水平，1、2-siMDR1B，3、4-vector-control，5、6-agent-control，7-siB245，8-mark，9-cell-control；B：P-gp水平
2.4 hTERT启动子介导的siMDR1B逆转卵巢癌细胞MDR 与对照组相比转染了hTERT启动子介导的siMDR1B表达元件的细胞对紫杉醇的耐药程度显著降低，hTERT启动子介导的siMDR1B能够用于卵巢癌细胞的MDR逆转。见图4。
图4 hTERT启动子介导的siMDR1B对紫杉醇的耐药程度
3 讨论
紫杉醇是卵巢肿瘤化疗常用药之一，肿瘤细胞对包括紫杉醇在内的治疗药物产生多药耐药(MDR)是导致对肿瘤化疗失败的重要原因。研究显示，肿瘤细胞中mdr1基因编码的P-gp蛋白过表达与MDR产生密切相关[8]。通过抑制肿瘤细胞中mdr1基因的表达可实现肿瘤细胞的耐药逆转[9]。RNAi技术可用于特异、高效地抑制细胞内靶基因的表达，在抑制mdr1基因以及MDR逆转研究中具有良好的应用潜力。已有研究显示，靶向mdr1基因的siRNA可抑制骨肉瘤、肾癌、肺癌、肝癌、卵巢癌细胞中的mdr1表达并逆转耐药[10-12]。然而在RNAi抗肿瘤研究中，实现siRNA对肿瘤组织细胞的特异性导入或表达是十分重要的，特别是以在一些正常组织细胞中也有表达的mdr1基因作为抑制靶标时。本研究构建了肿瘤细胞特异性启动子hTERT引导的靶向mdr1基因的siRNA表达元件，并证明其可在卵巢癌细胞中特异表达并有效抑制mdr1基因，并可逆转卵巢癌细胞对紫杉醇药物的耐药，为进一步应用RNAi技术开展卵巢癌MDR逆转研究提供了重要基础。, http://www.100md.com(林燕真 程通 张雅丽 李瑞银 杨连威 温兰玲)