糖尿病大鼠尿道α1受体和NGF/ProNGF异常表达的研究(2)
【Key words】 Diabetic rats； α1-adrenoceptor； NGF； proNGF； p75NTR； Urodynamics
First-author’s address：Hiser Medical Group of Qingdao City，Qingdao 266033，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.001
糖尿病膀胱病变主要以膀胱感觉受损、膀胱容量增加、逼尿肌收缩力受损和残余尿量增加为特点，上述损害主要归咎于糖尿病导致的外周神经病变[1-4]。与糖尿病膀胱功能障碍相比，糖尿病尿道功能障碍的发病机制阐述不够明确，之前的研究主要集中在尿流动力学角度[5-7]。研究表明，糖尿病可以提高尿道平滑肌对α1受体激动剂的敏感性，同时α1受体抑制剂可以缓解糖尿病尿道功能障碍，但是尿道α1受体的表达方面的研究没有得到应有的重视[5，8]。早期的研究表明，糖尿病患者支配尿道平滑肌的副交感和交感神经的病变可能最终导致尿道功能障碍。众所周知，神经生长因子(NGF)属于神经营养因子家族，存在于副交感和交感神经系统中，对神经元的存活、营养和发育起着重要的作用[9-11]。研究表明，NGF是由靶器官通过逆向轴浆运输来营养神经元，上述过程的缺失或弱化可能导致糖尿病神经病变[12-13]。同其他NGF类似，组织首先合成NGF的前体proNGF，随后经过蛋白酶的剪切生成成熟的NGF。proNGF被认为与P75NTR受体有较高亲和力，并且可以导致由P75NTR受体介导的神经元凋亡[14-15]。因此尿道中NGF/proNGF和P75NTR受体的表达值得进一步研究。本文就此问题展开研究，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物 雌性Whistar大鼠30只，重量230～250 g，购自山东大学实验动物中心(许可证号：SCXX20050015)，采用随机数字表法分为糖尿病组(DM)和对照组(control)，每组15只。
1.2 方法
1.2.1 建立糖尿病大鼠模型 禁食18 h后，糖尿病组大鼠给予单次腹腔注射链脲菌素(STZ，Sigma公司)65 mg/kg，对照组注射同等体积枸橼酸缓冲液。72 h后尾静脉采血测血糖(罗氏卓越型血糖仪)，确认空腹血糖大于300 mg/dL。
1.2.2 膀胱尿道同步测压 建模成功8周后，等容条件下检测膀胱内压(BP)及尿道充盈压(UPP)。按照Torimoto等[7]设计的方法，在氟烷吸入麻醉下，以PE50聚乙烯导管置入颈静脉以便给药。下腹正中切口，分离两侧输尿管，远端结扎，近端分别旷置体外。取双套管由膀胱顶部插入并固定于尿道内口，外管为PE160，用以隔离膀胱和尿道，并可持续注入生理盐水充盈尿道，内管为PE50，用以测定尿道充盈压。另外再置入一PE50导管于膀胱内，充盈膀胱并测定膀胱等容收缩压。手术结束后，更换为乌拉坦麻醉，通过膀胱导管缓慢注入生理盐水诱发膀胱收缩并记录膀胱等容收缩压，通过双套管外管外0.075 mL/s持续注入生理盐水灌注尿道，并经内管记录尿道充盈压。随后静脉应用坦索罗辛(0.5 mg/kg)后重复实验。实验结束后留取尿道标本。
, http://www.100md.com
1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 尿道组织低温快速匀浆后加入1 mL pH7.4 Tris/EDTA缓冲液(用前新鲜加入cocktail蛋白酶抑制剂混合物)，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min，取上清。BCA法测样本上清液的总蛋白浓度，作为目标蛋白NGF的参照。四倍体积杜氏磷酸缓冲液(DPBS 0.02% KCl，0.8% NaCl，0.02% KH2PO4，0.115% Na2HPO4，0.0133% CaCl2·2H2O及0.01%MgCl2·6H2O，pH 7.35)稀释样本，1∶50加入1 mol/L HCl，调节样品pH值至2.0～3.0，充分酸化样品，以利于受体上的NGF的解离；充分混合后于室温下(25 ℃)下静置；加入等体积的1 mol/L NaOH，调节pH至7.6；酸化后的样本于-20 ℃保存。应用大鼠NGF ELISA试剂盒(美国Promega公司)检测样本NGF含量[16]。
1.2.4 实时定量PCR(RT-qPCR) Trizol法(美国Invitrogen公司)提取大鼠尿道组织RNA，紫外分析测定RNA的浓度及纯度。应用Toyobo反转录试剂盒反转录得到互补DNA。引物设计和合成交由济南博尚生物公司完成，引物序列如下：α1A receptor：forward 5’-ACTGGATTCGCAGGACATTCT-3’，reverse 5’-TGGCTGCCGTTCTTCCTAGT-3’；α1Dreceptor：forward 5’-GGCACAGACAGGCACAATGA-3’，reverse 5’-CTGTTGCTCTTCCGCTCTGG-3’；NGF：forward 5’-AACAGGACTCACAGGAGCAA-3’，reverse 5’-CTTCCTGCTGAGCACACACA-3’；p75：forward 5’CGTGAACCAGACGCCCCCAC-3’，reverse 5’-CACGCTTGGTCAGGGGCAGG-3’；β-tubulin： forward 5’GCCAGAGTGGTGCAGGAAATA-3’，reverse 5’-TCACCACGTCCAGGACAGAGT-3’。使用罗氏RT-qPCR扩增仪，应用Takara SYBR Green试剂盒，采用两步法实时定量PCR，每次在延伸阶段读取吸光度值，(1)95° C预变性30 s；(2)95° C变性5 s，60° C退火20 s，共40循环。计算每个样本的目的/内参比值，确定目的基因的表达水平。, http://www.100md.com(冯小迪 冀明 史本康)
First-author’s address：Hiser Medical Group of Qingdao City，Qingdao 266033，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.001
糖尿病膀胱病变主要以膀胱感觉受损、膀胱容量增加、逼尿肌收缩力受损和残余尿量增加为特点，上述损害主要归咎于糖尿病导致的外周神经病变[1-4]。与糖尿病膀胱功能障碍相比，糖尿病尿道功能障碍的发病机制阐述不够明确，之前的研究主要集中在尿流动力学角度[5-7]。研究表明，糖尿病可以提高尿道平滑肌对α1受体激动剂的敏感性，同时α1受体抑制剂可以缓解糖尿病尿道功能障碍，但是尿道α1受体的表达方面的研究没有得到应有的重视[5，8]。早期的研究表明，糖尿病患者支配尿道平滑肌的副交感和交感神经的病变可能最终导致尿道功能障碍。众所周知，神经生长因子(NGF)属于神经营养因子家族，存在于副交感和交感神经系统中，对神经元的存活、营养和发育起着重要的作用[9-11]。研究表明，NGF是由靶器官通过逆向轴浆运输来营养神经元，上述过程的缺失或弱化可能导致糖尿病神经病变[12-13]。同其他NGF类似，组织首先合成NGF的前体proNGF，随后经过蛋白酶的剪切生成成熟的NGF。proNGF被认为与P75NTR受体有较高亲和力，并且可以导致由P75NTR受体介导的神经元凋亡[14-15]。因此尿道中NGF/proNGF和P75NTR受体的表达值得进一步研究。本文就此问题展开研究，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物 雌性Whistar大鼠30只，重量230～250 g，购自山东大学实验动物中心(许可证号：SCXX20050015)，采用随机数字表法分为糖尿病组(DM)和对照组(control)，每组15只。
1.2 方法
1.2.1 建立糖尿病大鼠模型 禁食18 h后，糖尿病组大鼠给予单次腹腔注射链脲菌素(STZ，Sigma公司)65 mg/kg，对照组注射同等体积枸橼酸缓冲液。72 h后尾静脉采血测血糖(罗氏卓越型血糖仪)，确认空腹血糖大于300 mg/dL。
1.2.2 膀胱尿道同步测压 建模成功8周后，等容条件下检测膀胱内压(BP)及尿道充盈压(UPP)。按照Torimoto等[7]设计的方法，在氟烷吸入麻醉下，以PE50聚乙烯导管置入颈静脉以便给药。下腹正中切口，分离两侧输尿管，远端结扎，近端分别旷置体外。取双套管由膀胱顶部插入并固定于尿道内口，外管为PE160，用以隔离膀胱和尿道，并可持续注入生理盐水充盈尿道，内管为PE50，用以测定尿道充盈压。另外再置入一PE50导管于膀胱内，充盈膀胱并测定膀胱等容收缩压。手术结束后，更换为乌拉坦麻醉，通过膀胱导管缓慢注入生理盐水诱发膀胱收缩并记录膀胱等容收缩压，通过双套管外管外0.075 mL/s持续注入生理盐水灌注尿道，并经内管记录尿道充盈压。随后静脉应用坦索罗辛(0.5 mg/kg)后重复实验。实验结束后留取尿道标本。
, http://www.100md.com
1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 尿道组织低温快速匀浆后加入1 mL pH7.4 Tris/EDTA缓冲液(用前新鲜加入cocktail蛋白酶抑制剂混合物)，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min，取上清。BCA法测样本上清液的总蛋白浓度，作为目标蛋白NGF的参照。四倍体积杜氏磷酸缓冲液(DPBS 0.02% KCl，0.8% NaCl，0.02% KH2PO4，0.115% Na2HPO4，0.0133% CaCl2·2H2O及0.01%MgCl2·6H2O，pH 7.35)稀释样本，1∶50加入1 mol/L HCl，调节样品pH值至2.0～3.0，充分酸化样品，以利于受体上的NGF的解离；充分混合后于室温下(25 ℃)下静置；加入等体积的1 mol/L NaOH，调节pH至7.6；酸化后的样本于-20 ℃保存。应用大鼠NGF ELISA试剂盒(美国Promega公司)检测样本NGF含量[16]。
1.2.4 实时定量PCR(RT-qPCR) Trizol法(美国Invitrogen公司)提取大鼠尿道组织RNA，紫外分析测定RNA的浓度及纯度。应用Toyobo反转录试剂盒反转录得到互补DNA。引物设计和合成交由济南博尚生物公司完成，引物序列如下：α1A receptor：forward 5’-ACTGGATTCGCAGGACATTCT-3’，reverse 5’-TGGCTGCCGTTCTTCCTAGT-3’；α1Dreceptor：forward 5’-GGCACAGACAGGCACAATGA-3’，reverse 5’-CTGTTGCTCTTCCGCTCTGG-3’；NGF：forward 5’-AACAGGACTCACAGGAGCAA-3’，reverse 5’-CTTCCTGCTGAGCACACACA-3’；p75：forward 5’CGTGAACCAGACGCCCCCAC-3’，reverse 5’-CACGCTTGGTCAGGGGCAGG-3’；β-tubulin： forward 5’GCCAGAGTGGTGCAGGAAATA-3’，reverse 5’-TCACCACGTCCAGGACAGAGT-3’。使用罗氏RT-qPCR扩增仪，应用Takara SYBR Green试剂盒，采用两步法实时定量PCR，每次在延伸阶段读取吸光度值，(1)95° C预变性30 s；(2)95° C变性5 s，60° C退火20 s，共40循环。计算每个样本的目的/内参比值，确定目的基因的表达水平。, http://www.100md.com(冯小迪 冀明 史本康)