miR—195表达调控对大肠癌细胞HT—29增殖和凋亡的影响及其机制探讨(2)
1.3 CCK-8法检测细胞增殖情况 HT-29细胞接种于96孔培养板，培养液体积200 μL，按上述分组转染，分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL CCK-8(Dojindo公司)，37 ℃继续培养2 h后于酶标仪上450 nm测定各孔吸光度(A450)。每个时间点设3个复孔，实验重复3次，根据时间和吸光度值绘制增殖曲线。
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 HT-29细胞接种于12孔培养板，分别转染miR-195 mimics和NC，培养48 h后收集细胞，PBS洗涤后依次分别加入Annexin V-FITC(碧云天公司)室温避光孵育10 min和碘化丙啶(PI)(碧云天公司)冰浴避光孵育30 min，上机检测，实验重复3次。
1.5 Western blot检测VEGFA蛋白的表达 转染72 h后，用Western及IP细胞裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，每个泳道上样40 μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳分离，电转到PVDF膜上，5%牛奶封闭非特异位点，抗VEGFA抗体(Santa Cruz，1∶500)4 ℃孵育过夜。相应的二抗(1∶1000)室温孵育1 h，暗室显影，以Tubulin作为内参，以VEGFA蛋白与Tubulin蛋白条带的光密度比值计算VEGFA蛋白的相对含量，实验重复3次。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用(x±s)表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组细胞miR-195表达比较 miR-195 mimics转染组的miR-195表达水平明显高于NC组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。
2.2 两组细胞增殖情况比较 CCK-8检测两组转染后细胞增殖情况，miR-195 mimics转染组于48、72 h增殖率较相应时间点的NC组明显下降，两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。
2.3 两组细胞凋亡情况比较 转染miR-195 mimics至HT-29细胞，培养48 h后行流式细胞仪检测，miR-195 mimics转染组凋亡细胞较NC组明显增加，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3～4。
, 百拇医药
2.4 两组细胞的VEGFA表达 qRT-PCR和Western blot检测显示，miR-195 mimics转染组细胞VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均较NC组明显降低，两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。
3 讨论
目前已有研究证实miRNAs在大肠癌的诊断、预后判断及治疗效果预测中均发挥作用[7-9]。另外，miRNAs在癌前病变发展，对大肠癌细胞生物学行为的影响，新生血管生成中的作用等基础领域研究亦不断有新的进展[10-12]。研究发现，miR-195在多种肿瘤的发生发展有关。Guo等[13]报道与正常组织比较，miR-195在非小细胞肺癌组织和细胞株的表达明显下调，过表达miR-195能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、转移和侵袭能力。miR-195通过作用于其靶基因脂肪酸合酶(FASN)，抑制骨肉瘤细胞的转移和侵袭[14]。Yang等[15]亦报道，miR-195在乳腺癌细胞株和多药耐药的乳腺癌组织中均表达下降，上调miR-195的表达可以抑制乳腺癌细胞的活力，促进其凋亡，增加其对阿霉素治疗的敏感性。miR-195在肾上腺皮质癌患者的癌组织和血清中表达水平均降低，其血清低表达与较短的无复发生存和较短的总体生存有关，对于肾上腺皮质癌患者的预后预测有一定的价值[16]。多个研究显示，与正常组织比较，miR-195在CRC组织表达降低[5-6]。在本研究中，笔者转染miR-195 mimics使大肠癌细胞HT-29过表达miR-195，显示细胞增殖减少、凋亡增多，提示miR-195在CRC中发挥促凋亡的作用，与前面研究一致。
, 百拇医药
VEGFA是肿瘤血管生成的主要刺激因子之一，通过与其受体VEGFR-2作用，促进内皮细胞的增殖、侵袭、转移。VEGFA在CRC组织中表达上调，高表达的VEGFA与肿瘤进展及侵袭相关，是生存的一个重要预测因素[17]。使用VEGFA shRNA抑制RKO大肠癌细胞的VEGFA表达后，可使细胞周期停滞，减弱细胞增殖和侵袭能力，裸鼠种植瘤生长延缓[18]。Tai等[19]用siRNA抑制大肠癌Volo细胞的VEGFA表达后，亦可以抑制细胞增殖和转移，促进凋亡。于多种大肠癌细胞株，如SW620、HCT-116上使用RNAi技术干扰VEGFA表达也可得到类似的结果[20-21]。上述研究表明，VEGFA与大肠癌细胞的生物学特性相关。笔者通过电子信息学网站预测发现VEGFA是miR-195潜在靶基因之一。转染miR-195 mimics后，与阴性对照组相比，VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均明显下调，说明在CRC中miR-195可能通过抑制VEGFA的表达，影响细胞的增殖和凋亡，可能是其参与肿瘤发生发展的机制之一。
综上所述，miR-195在CRC中发挥着类似抑癌基因的作用，随着研究的不断深入，阐明miRNA在肿瘤发生发展过程中的作用机制，以miRNA作为诊断和治疗的靶点，具有巨大的潜在价值。
, 百拇医药
参考文献
[1] Liu R，Yang M，Meng Y，et al.Tumor-suppressive function of mir-139-5p in esophageal squamous cell carcinoma[J].PLoS One，2013，8(10)：e77 068.
[2] Collins A L，Wojcik S，Liu J，et al.A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma[J].Ann Surg Oncol，2014，21(1)：133-138., 百拇医药(吴巍芸)
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 HT-29细胞接种于12孔培养板，分别转染miR-195 mimics和NC，培养48 h后收集细胞，PBS洗涤后依次分别加入Annexin V-FITC(碧云天公司)室温避光孵育10 min和碘化丙啶(PI)(碧云天公司)冰浴避光孵育30 min，上机检测，实验重复3次。
1.5 Western blot检测VEGFA蛋白的表达 转染72 h后，用Western及IP细胞裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，每个泳道上样40 μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳分离，电转到PVDF膜上，5%牛奶封闭非特异位点，抗VEGFA抗体(Santa Cruz，1∶500)4 ℃孵育过夜。相应的二抗(1∶1000)室温孵育1 h，暗室显影，以Tubulin作为内参，以VEGFA蛋白与Tubulin蛋白条带的光密度比值计算VEGFA蛋白的相对含量，实验重复3次。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用(x±s)表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组细胞miR-195表达比较 miR-195 mimics转染组的miR-195表达水平明显高于NC组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。
2.2 两组细胞增殖情况比较 CCK-8检测两组转染后细胞增殖情况，miR-195 mimics转染组于48、72 h增殖率较相应时间点的NC组明显下降，两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。
2.3 两组细胞凋亡情况比较 转染miR-195 mimics至HT-29细胞，培养48 h后行流式细胞仪检测，miR-195 mimics转染组凋亡细胞较NC组明显增加，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3～4。
, 百拇医药
2.4 两组细胞的VEGFA表达 qRT-PCR和Western blot检测显示，miR-195 mimics转染组细胞VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均较NC组明显降低，两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。
3 讨论
目前已有研究证实miRNAs在大肠癌的诊断、预后判断及治疗效果预测中均发挥作用[7-9]。另外，miRNAs在癌前病变发展，对大肠癌细胞生物学行为的影响，新生血管生成中的作用等基础领域研究亦不断有新的进展[10-12]。研究发现，miR-195在多种肿瘤的发生发展有关。Guo等[13]报道与正常组织比较，miR-195在非小细胞肺癌组织和细胞株的表达明显下调，过表达miR-195能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、转移和侵袭能力。miR-195通过作用于其靶基因脂肪酸合酶(FASN)，抑制骨肉瘤细胞的转移和侵袭[14]。Yang等[15]亦报道，miR-195在乳腺癌细胞株和多药耐药的乳腺癌组织中均表达下降，上调miR-195的表达可以抑制乳腺癌细胞的活力，促进其凋亡，增加其对阿霉素治疗的敏感性。miR-195在肾上腺皮质癌患者的癌组织和血清中表达水平均降低，其血清低表达与较短的无复发生存和较短的总体生存有关，对于肾上腺皮质癌患者的预后预测有一定的价值[16]。多个研究显示，与正常组织比较，miR-195在CRC组织表达降低[5-6]。在本研究中，笔者转染miR-195 mimics使大肠癌细胞HT-29过表达miR-195，显示细胞增殖减少、凋亡增多，提示miR-195在CRC中发挥促凋亡的作用，与前面研究一致。
, 百拇医药
VEGFA是肿瘤血管生成的主要刺激因子之一，通过与其受体VEGFR-2作用，促进内皮细胞的增殖、侵袭、转移。VEGFA在CRC组织中表达上调，高表达的VEGFA与肿瘤进展及侵袭相关，是生存的一个重要预测因素[17]。使用VEGFA shRNA抑制RKO大肠癌细胞的VEGFA表达后，可使细胞周期停滞，减弱细胞增殖和侵袭能力，裸鼠种植瘤生长延缓[18]。Tai等[19]用siRNA抑制大肠癌Volo细胞的VEGFA表达后，亦可以抑制细胞增殖和转移，促进凋亡。于多种大肠癌细胞株，如SW620、HCT-116上使用RNAi技术干扰VEGFA表达也可得到类似的结果[20-21]。上述研究表明，VEGFA与大肠癌细胞的生物学特性相关。笔者通过电子信息学网站预测发现VEGFA是miR-195潜在靶基因之一。转染miR-195 mimics后，与阴性对照组相比，VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均明显下调，说明在CRC中miR-195可能通过抑制VEGFA的表达，影响细胞的增殖和凋亡，可能是其参与肿瘤发生发展的机制之一。
综上所述，miR-195在CRC中发挥着类似抑癌基因的作用，随着研究的不断深入，阐明miRNA在肿瘤发生发展过程中的作用机制，以miRNA作为诊断和治疗的靶点，具有巨大的潜在价值。
, 百拇医药
参考文献
[1] Liu R，Yang M，Meng Y，et al.Tumor-suppressive function of mir-139-5p in esophageal squamous cell carcinoma[J].PLoS One，2013，8(10)：e77 068.
[2] Collins A L，Wojcik S，Liu J，et al.A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma[J].Ann Surg Oncol，2014，21(1)：133-138., 百拇医药(吴巍芸)