共焦显微镜下真菌菌丝形态的观察分析(2)
【Key words】 Confocal microscopy； Hypha； Fungal keratitis
First-author’s address： The Second People’s Hospital of Zhengzhou City，Zhengzhou 450006，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.015
真菌性角膜炎是真菌直接感染角膜引起的一种严重的致盲性角膜病，是感染性角膜病致盲的首位原因[1]。该病若控制不及时，极易造成角膜穿孔、前房积脓、眼内炎等严重后果，因此对本病的早期诊断和治疗尤为重要。角膜共焦激光显微镜是一种快速、有效、无创伤、可重复进行的活体检查方法，能动态观察真菌感染在不同时相角膜组织中的菌丝和孢子的情况，并能动态观察治疗效果，敏感性和安全性高，越来越得到临床广泛的认可。但是，应用共焦显微镜诊断真菌性角膜炎尚依赖检查者的技术经验，目前，可供参考的真菌菌丝共焦图片有限，本研究通过对75例在共焦显微镜下明确查到菌丝的真菌性角膜炎患者的菌丝形态进行仔细观察分析后，发现真菌菌丝的形态各异，患病初期、活动期，用药后，以及不同菌种形态表现也不同，现将其特征总结如下。
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1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2014年8月-2015年10月就诊于本院的真菌性角膜炎患者75例(75只眼)作为研究对象，入选患者均在共焦显微镜下明确观察到菌丝，其中男39例(39只眼)，女36例(36只眼)；年龄20～75岁。其中17例在检查前行药物抗真菌治疗，其余58例检查前未行抗真菌治疗。
1.2 方法 5例患者在共焦激光显微镜下查出菌丝后行抗真菌治疗，分别于用药后半个月、1个月及2个月后复查，所有患者均在裂隙灯显微镜下观察后并拍照，再行角膜共焦激光显微镜检查，具体方法如下。
1.2.1 裂隙灯显微镜检查及照相 使用拓普康SL-D7型号的裂隙灯显微镜，以直接焦点照明法检查，宽光照射采集角膜上皮病变，窄光照射采集角膜病变层次，后部反光照射法采集角膜内皮情况。
1.2.2 共焦激光显微镜检查 仪器：共焦激光显微镜是由海德堡视网膜激光断层扫描系统3代(HRT3)和Rostock角膜模块组件(RCM)组成。主要参数：激光光源波长670 nm，放大倍率×800，数字分辨率：横向1μm/像素，纵向2 μm/像素。横向视野：400 μm×400 μm。检查方法：患眼滴用盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔凯因)表面麻醉后，将卡波姆眼用凝胶滴于物镜头表面，盖上无菌角膜接触帽。调整操纵台高度和CCD摄像头位置，使CCD摄像头的光轴与激光扫描摄像头的光轴垂直。打开软件，调整焦平面，当图像窗口显示为全白时，将焦平面设置为0。患者下颌和前额分别固定于下颌托和前额托上，根据病灶位置调整固视灯位置，并嘱患者注视前方的固视灯。将激光扫描摄像头缓慢前移，直到角膜接触帽轻微接触患者角膜病灶。当显示器上出现角膜图像时，微调焦距，连续扫描角膜各层结构，重点连续扫描病灶区及病灶周边部位，仔细观察角膜各层结构情况并采集有意义图像。
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2 结果
共焦激光显微镜下观察角膜溃疡及周边的改变，显示角膜病灶区组织破坏，各层结构紊乱，溃疡区及其周围各层可见不同程度的炎性细胞浸润，基质层水肿态，严重者深层基质及内皮窥不入，菌丝根据病变程度不同分布深度不同，从上皮层、浅基质层到深基质层、甚至内皮层可见到菌丝；菌丝形态各异，根据病变不同时期和治疗阶段以及不同种的菌丝形态特征不同，回顾性分析不同患者的菌丝特点，选择典型病例总结如下。
2.1 感染早期 患者角膜外伤史0～3 d，主要是植物外伤，该组病例有5例。共焦激光显微镜检查显示病灶区内及边缘表层及浅基质层可见少量丝状物，部分见分枝，呈高反光，较细。
2.2 活动期 可见大量菌丝，排列密集，纵横交错，可见节段、分支，呈串珠样(图1A)、竹节样(图1C)或树枝样(图1E)，有的呈水平排列(图1A、1B、1C)，菌丝较粗，分支少；有的呈簇状垂直或斜行排列(图1D、1F)，菌丝较细；菌丝大部分呈高反光，部分呈小虫状低反光(图1E)，夹杂圆点状低反光，有时为高反光，共48例48眼。
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图1 活动期
2.3 使用过抗真菌药物 17例患者在检查前进行过抗真菌药物治疗2 d～1周不等，共焦激光显微镜下不同患者表现不同，部分病例在浅层可见断裂的菌丝节段，呈高反光，有的可见肿胀的菌丝，有的菌丝变得僵直，还有的菌丝形态奇特，粗细不一。
2.4 抗真菌药物治疗后复查 5例复查患者共焦激光显微镜下显示3例已查不到菌丝，2例菌丝减少或仅存少量节段，病灶区瘢痕化，上皮层修复完全，基质层纤维化，反光增强。角膜病灶较前局限，边界变清，浸润灶变薄，透明度增加，角膜水肿明显减轻甚至消失。
2.5 不同孢子形态 部分病例菌丝旁可见较多梭形高反光(图2A)，有些病例菌丝呈簇状，垂直排列，其顶端可见小点状高反光(图2B)，有时呈圆珠状低反光(图2C)，个别病例菌丝旁可见短棒样高反光，规则排列于菌丝两侧(图2D)。
3 讨论
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真菌性角膜炎是感染性角膜病致盲的首位原因，本病一般有明显的致病危险因素[1]。有文章报道，不同菌属的感染危险因素也有不同，镰刀菌属和链格孢霉属以植物性外伤史为主，其次为迷眼史；曲霉菌属多由迷眼史引起，其次为植物和铁质异物外伤史[2]。因此，角膜溃疡患者的病史至关重要，应详细询问。
真菌性角膜炎危害严重的一个主要原因就是缺乏正确的早期诊断，从而导致误诊并延误治疗。真菌性角膜炎的早期诊断技术有多种[3]。KOH湿片法简单、快速、经济，但受取材部位影响较大、漏诊率高。Gram染色法和Giemsa染色法为经典染色法，但在菌丝量少时检出率不高、敏感性差。PAS染色法虽然特异性高，但染色时间较长、操作复杂、所需试剂多且结果需要有专业经验判断，不能观察组织细胞等细微形态变化。荧光染色法简单、快捷、敏感性和特异性高，但须配备一台荧光显微镜，且紫外荧光对人体的危害等限制了其临床应用。PCR技术是一种新型技术，有诸多的优点，但是对实验条件要求较高，否则容易污染，出现假阳性率引起误诊，且不能鉴别菌株。共焦激光显微镜具有无创、可重复性强、快速、有效等优点，自1989年Cavanagh等[4]首次将其应用于活体人眼的观察，在过去的26年间，越来越得到眼科医生的青睐，甚至有些医生把它称为眼表医生的第三只眼。, http://www.100md.com(杨洁 牛际铭 杜敏 刘钰 邵玲 闫淑)
First-author’s address： The Second People’s Hospital of Zhengzhou City，Zhengzhou 450006，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.015
真菌性角膜炎是真菌直接感染角膜引起的一种严重的致盲性角膜病，是感染性角膜病致盲的首位原因[1]。该病若控制不及时，极易造成角膜穿孔、前房积脓、眼内炎等严重后果，因此对本病的早期诊断和治疗尤为重要。角膜共焦激光显微镜是一种快速、有效、无创伤、可重复进行的活体检查方法，能动态观察真菌感染在不同时相角膜组织中的菌丝和孢子的情况，并能动态观察治疗效果，敏感性和安全性高，越来越得到临床广泛的认可。但是，应用共焦显微镜诊断真菌性角膜炎尚依赖检查者的技术经验，目前，可供参考的真菌菌丝共焦图片有限，本研究通过对75例在共焦显微镜下明确查到菌丝的真菌性角膜炎患者的菌丝形态进行仔细观察分析后，发现真菌菌丝的形态各异，患病初期、活动期，用药后，以及不同菌种形态表现也不同，现将其特征总结如下。
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1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2014年8月-2015年10月就诊于本院的真菌性角膜炎患者75例(75只眼)作为研究对象，入选患者均在共焦显微镜下明确观察到菌丝，其中男39例(39只眼)，女36例(36只眼)；年龄20～75岁。其中17例在检查前行药物抗真菌治疗，其余58例检查前未行抗真菌治疗。
1.2 方法 5例患者在共焦激光显微镜下查出菌丝后行抗真菌治疗，分别于用药后半个月、1个月及2个月后复查，所有患者均在裂隙灯显微镜下观察后并拍照，再行角膜共焦激光显微镜检查，具体方法如下。
1.2.1 裂隙灯显微镜检查及照相 使用拓普康SL-D7型号的裂隙灯显微镜，以直接焦点照明法检查，宽光照射采集角膜上皮病变，窄光照射采集角膜病变层次，后部反光照射法采集角膜内皮情况。
1.2.2 共焦激光显微镜检查 仪器：共焦激光显微镜是由海德堡视网膜激光断层扫描系统3代(HRT3)和Rostock角膜模块组件(RCM)组成。主要参数：激光光源波长670 nm，放大倍率×800，数字分辨率：横向1μm/像素，纵向2 μm/像素。横向视野：400 μm×400 μm。检查方法：患眼滴用盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔凯因)表面麻醉后，将卡波姆眼用凝胶滴于物镜头表面，盖上无菌角膜接触帽。调整操纵台高度和CCD摄像头位置，使CCD摄像头的光轴与激光扫描摄像头的光轴垂直。打开软件，调整焦平面，当图像窗口显示为全白时，将焦平面设置为0。患者下颌和前额分别固定于下颌托和前额托上，根据病灶位置调整固视灯位置，并嘱患者注视前方的固视灯。将激光扫描摄像头缓慢前移，直到角膜接触帽轻微接触患者角膜病灶。当显示器上出现角膜图像时，微调焦距，连续扫描角膜各层结构，重点连续扫描病灶区及病灶周边部位，仔细观察角膜各层结构情况并采集有意义图像。
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2 结果
共焦激光显微镜下观察角膜溃疡及周边的改变，显示角膜病灶区组织破坏，各层结构紊乱，溃疡区及其周围各层可见不同程度的炎性细胞浸润，基质层水肿态，严重者深层基质及内皮窥不入，菌丝根据病变程度不同分布深度不同，从上皮层、浅基质层到深基质层、甚至内皮层可见到菌丝；菌丝形态各异，根据病变不同时期和治疗阶段以及不同种的菌丝形态特征不同，回顾性分析不同患者的菌丝特点，选择典型病例总结如下。
2.1 感染早期 患者角膜外伤史0～3 d，主要是植物外伤，该组病例有5例。共焦激光显微镜检查显示病灶区内及边缘表层及浅基质层可见少量丝状物，部分见分枝，呈高反光，较细。
2.2 活动期 可见大量菌丝，排列密集，纵横交错，可见节段、分支，呈串珠样(图1A)、竹节样(图1C)或树枝样(图1E)，有的呈水平排列(图1A、1B、1C)，菌丝较粗，分支少；有的呈簇状垂直或斜行排列(图1D、1F)，菌丝较细；菌丝大部分呈高反光，部分呈小虫状低反光(图1E)，夹杂圆点状低反光，有时为高反光，共48例48眼。
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图1 活动期
2.3 使用过抗真菌药物 17例患者在检查前进行过抗真菌药物治疗2 d～1周不等，共焦激光显微镜下不同患者表现不同，部分病例在浅层可见断裂的菌丝节段，呈高反光，有的可见肿胀的菌丝，有的菌丝变得僵直，还有的菌丝形态奇特，粗细不一。
2.4 抗真菌药物治疗后复查 5例复查患者共焦激光显微镜下显示3例已查不到菌丝，2例菌丝减少或仅存少量节段，病灶区瘢痕化，上皮层修复完全，基质层纤维化，反光增强。角膜病灶较前局限，边界变清，浸润灶变薄，透明度增加，角膜水肿明显减轻甚至消失。
2.5 不同孢子形态 部分病例菌丝旁可见较多梭形高反光(图2A)，有些病例菌丝呈簇状，垂直排列，其顶端可见小点状高反光(图2B)，有时呈圆珠状低反光(图2C)，个别病例菌丝旁可见短棒样高反光，规则排列于菌丝两侧(图2D)。
3 讨论
, 百拇医药
真菌性角膜炎是感染性角膜病致盲的首位原因，本病一般有明显的致病危险因素[1]。有文章报道，不同菌属的感染危险因素也有不同，镰刀菌属和链格孢霉属以植物性外伤史为主，其次为迷眼史；曲霉菌属多由迷眼史引起，其次为植物和铁质异物外伤史[2]。因此，角膜溃疡患者的病史至关重要，应详细询问。
真菌性角膜炎危害严重的一个主要原因就是缺乏正确的早期诊断，从而导致误诊并延误治疗。真菌性角膜炎的早期诊断技术有多种[3]。KOH湿片法简单、快速、经济，但受取材部位影响较大、漏诊率高。Gram染色法和Giemsa染色法为经典染色法，但在菌丝量少时检出率不高、敏感性差。PAS染色法虽然特异性高，但染色时间较长、操作复杂、所需试剂多且结果需要有专业经验判断，不能观察组织细胞等细微形态变化。荧光染色法简单、快捷、敏感性和特异性高，但须配备一台荧光显微镜，且紫外荧光对人体的危害等限制了其临床应用。PCR技术是一种新型技术，有诸多的优点，但是对实验条件要求较高，否则容易污染，出现假阳性率引起误诊，且不能鉴别菌株。共焦激光显微镜具有无创、可重复性强、快速、有效等优点，自1989年Cavanagh等[4]首次将其应用于活体人眼的观察，在过去的26年间，越来越得到眼科医生的青睐，甚至有些医生把它称为眼表医生的第三只眼。, http://www.100md.com(杨洁 牛际铭 杜敏 刘钰 邵玲 闫淑)