1.2 方法

    1.2.1 手术原则 严格遵循直肠癌根治原则和手术无瘤原则，所有入选病例的手术过程均由同一组医师实施。

    1.2.2 标本采集 所有患者手术前1 d于清晨空腹状态下采集肘静脉血5 mL，腔镜组在气腹结束后采集肘静脉血5 mL，开腹组在手术后立即采集肘静脉血5 mL。EDTA抗凝，离心去上清后-80 ℃冰箱保存。

    1.2.3 CK20 mRNA检测 RT-PCR方法检测，步骤如下：(1)单核细胞分离：标本解冻，取2.5 mL后置于无菌管中，加入Tris 250 μL，12 000 r/min离心5 min后去上清，沉淀物加入PBS缓冲液500 μL悬浮，继续12 000 r/min离心5 min后去上清；(2)提取RNA：加入RNA提取液，75%乙醇200 μL漂洗，离心后吸干，无水酶溶解RNA；(3)RT-PCR反应：70 ℃预变性5 min，冰浴防止复性，取RT反应液18 μL、逆转录酶1 μL、RNasin 1 μL加入无菌离心管并混匀，在每个反应管中加入20 μL上述反应液和预变性的RNA 5 μL，37 ℃水浴30 min；(4)PCR扩增：取PCR反应液43 μL、Taq酶2 μL置于无菌离心管混匀，加入RT-PCR反应产物进行扩增，按变性、退火、延伸的步骤35个循环，最终于4 ℃保存。

    1.2.4 产物分析 (1)定性分析：将产物以2%琼脂糖凝胶电泳 ......