受胆固醇调节的变异剪接体及其意义(2)
1 材料与方法
1.1 实验细胞 HepG2细胞系购于中科院昆明细胞库。
1.2 主要试剂和器材 MEM培养基，无菌PBS购自武汉博士德生物有限公司，胎牛血清(FBS)购自依科赛生物科技(太仓)有限公司，0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司，脂蛋白缺乏人血清(LPDS)，人低密度脂蛋白(Human LDL)购自上海昂羽生物技术有限公司，25-Hydroxycholesterol(25-HC)购自美国Sigma-Aldrich公司。4 ℃离心机购自德国Thermo公司，PCR仪和荧光定量PCR仪购自杭州博日科技有限公司。除GAPDH为引用文献外，其余引物根据Pubmed Gene提供的LDLR基因的RNA序列，用Primer Premier软件设计，由华大基因合成，引物序列见表1。
1.3 方法
1.3.1 细胞分组 将细胞置于37 ℃ 5%CO2，95%湿度的细胞培养箱中培养1 d，待细胞生长至对数生长期且融合面积大于70%时，正常组用10%MEM培养，低胆固醇模型组用不同浓度的LPDS血清培养24 h，高胆固醇模型组加入不同浓度含25-Hydroxycholesterol的10%MEM培养和含不同浓度的LDL的10%MEM血清培養24 h。
, 百拇医药
1.3.2 普通PCR 提取正常组细胞的RNA，反转录成cDNA后，之后使用特异性引物进行普通PCR扩增。2%琼脂糖凝胶，用荧光染料4S Green Plus预染，取10 μL PCR扩增产物电泳，紫外凝胶成像分析仪观察并拍照，检测正常细胞LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-?Exon13是否存在。
1.3.3 RT-PCR 提取不同分组细胞的RNA，反转录成cDNA后，以cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒，设定程序：95 ℃预变性30 s，40个循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)，熔解曲线(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)。分别检测不同分组LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCR1-?Exon2、HMGCR-?Exon13 mRNA表达。
1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，用(Mean±SEM)表示所有数据，高、低胆固醇模型组与正常组比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HepG2细胞中LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-?Exon13等变异剪接体mRNA表达检测 普通PCR检测结果HepG2显示中均有LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-Exon?13及其全长的mRNA表达，见图1。
3 讨论
新近的研究表明，表观遗传机制尤其是组蛋白修饰与选择性剪接有密切的关系[15-16]，组蛋白修饰对于选择性剪接调节的直接证据来自分析一系列基因的组蛋白修饰与选择性剪接的关系[17]，研究发现一些基因的选择性剪接依赖于多聚嘧啶束结合蛋白(PTB)剪接因子[18-20]。PTB可以与剪接因子U2AF竞争结合3’剪接位点，从而对pre-mRNA的剪接起到负性调控作用[21]。有研究显示，HepG2 细胞系转染PTB的干扰RNA后，PTB mRNA 表达下降到68%，蛋白表达下调到66%[22]。此时，检测到选择性变异剪接体LDLR-?Exon4和LDLR-?Exon12表达均下调，说明LDLR是PTB作用的靶基因。文献[23-34]报道，H3K36me3在基因外显子上富集与选择性剪接外显子的跳跃有关。在依赖于PTB的选择性剪接的外显子中，高浓度的H3K36me3能招募染色质键合蛋白MRG15，通过蛋白质间的相互作用，MRG15招募剪接因子多聚嘧啶序列结合蛋(Polypyrimidine tract-binding protein，PTB)，使PTB结合到相对较弱的选择性外显子上，从而抑制PTB依赖性选择性外显子的纳入，诱导外显子跳跃。因此，推测LDLR pre-mRNA的第4、12外显子缺失，HMGCR pre-mRNA第13外显子的缺失及HMGCS1 pre-mRNA第2外显子是由PTB进行调节的，在高胆固醇血症时，组蛋白H3K36的三甲基化水平在缺失外显子周围水平升高，可与染色质结合蛋白(MRG15)结合，MRG15又可与PTB相连，通过PTB与剪接因子U2AF竞争结合3’剪接位点，从而影响外显子使其被切除，LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2和HMGCR-Exon?13产物的比例将明显上升，各基因全长表达下降，从而不能有效地降低血胆固醇。简言之，组蛋白修饰可能在LDLR pre-mRNA的选择性剪接中发挥了重要作用。
, 百拇医药
本文通过RT-PCR检测高、低胆固醇模型组与正常组相比，LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2和HMGCR-Exon?13等变异剪接体表达确实受胆固醇的影响，与高胆固醇血症有着密切关系，但是这些变化是否由于表观遗传修饰引起的，还需要进一步的研究。
参考文献
[1] Lu N，Li Y，Qin H，et al.Gossypin Up-Regulates LDL Receptor through Activation of ERK Pathway：A Signaling Mechanism for the Hypocholesterolemic Effect[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2008，56(23)：11526-11532., http://www.100md.com(庞亚娜 赵晋枫 董元坤)
1.1 实验细胞 HepG2细胞系购于中科院昆明细胞库。
1.2 主要试剂和器材 MEM培养基，无菌PBS购自武汉博士德生物有限公司，胎牛血清(FBS)购自依科赛生物科技(太仓)有限公司，0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司，脂蛋白缺乏人血清(LPDS)，人低密度脂蛋白(Human LDL)购自上海昂羽生物技术有限公司，25-Hydroxycholesterol(25-HC)购自美国Sigma-Aldrich公司。4 ℃离心机购自德国Thermo公司，PCR仪和荧光定量PCR仪购自杭州博日科技有限公司。除GAPDH为引用文献外，其余引物根据Pubmed Gene提供的LDLR基因的RNA序列，用Primer Premier软件设计，由华大基因合成，引物序列见表1。
1.3 方法
1.3.1 细胞分组 将细胞置于37 ℃ 5%CO2，95%湿度的细胞培养箱中培养1 d，待细胞生长至对数生长期且融合面积大于70%时，正常组用10%MEM培养，低胆固醇模型组用不同浓度的LPDS血清培养24 h，高胆固醇模型组加入不同浓度含25-Hydroxycholesterol的10%MEM培养和含不同浓度的LDL的10%MEM血清培養24 h。
, 百拇医药
1.3.2 普通PCR 提取正常组细胞的RNA，反转录成cDNA后，之后使用特异性引物进行普通PCR扩增。2%琼脂糖凝胶，用荧光染料4S Green Plus预染，取10 μL PCR扩增产物电泳，紫外凝胶成像分析仪观察并拍照，检测正常细胞LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-?Exon13是否存在。
1.3.3 RT-PCR 提取不同分组细胞的RNA，反转录成cDNA后，以cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒，设定程序：95 ℃预变性30 s，40个循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)，熔解曲线(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)。分别检测不同分组LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCR1-?Exon2、HMGCR-?Exon13 mRNA表达。
1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，用(Mean±SEM)表示所有数据，高、低胆固醇模型组与正常组比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HepG2细胞中LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-?Exon13等变异剪接体mRNA表达检测 普通PCR检测结果HepG2显示中均有LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2、HMGCR-Exon?13及其全长的mRNA表达，见图1。
3 讨论
新近的研究表明，表观遗传机制尤其是组蛋白修饰与选择性剪接有密切的关系[15-16]，组蛋白修饰对于选择性剪接调节的直接证据来自分析一系列基因的组蛋白修饰与选择性剪接的关系[17]，研究发现一些基因的选择性剪接依赖于多聚嘧啶束结合蛋白(PTB)剪接因子[18-20]。PTB可以与剪接因子U2AF竞争结合3’剪接位点，从而对pre-mRNA的剪接起到负性调控作用[21]。有研究显示，HepG2 细胞系转染PTB的干扰RNA后，PTB mRNA 表达下降到68%，蛋白表达下调到66%[22]。此时，检测到选择性变异剪接体LDLR-?Exon4和LDLR-?Exon12表达均下调，说明LDLR是PTB作用的靶基因。文献[23-34]报道，H3K36me3在基因外显子上富集与选择性剪接外显子的跳跃有关。在依赖于PTB的选择性剪接的外显子中，高浓度的H3K36me3能招募染色质键合蛋白MRG15，通过蛋白质间的相互作用，MRG15招募剪接因子多聚嘧啶序列结合蛋(Polypyrimidine tract-binding protein，PTB)，使PTB结合到相对较弱的选择性外显子上，从而抑制PTB依赖性选择性外显子的纳入，诱导外显子跳跃。因此，推测LDLR pre-mRNA的第4、12外显子缺失，HMGCR pre-mRNA第13外显子的缺失及HMGCS1 pre-mRNA第2外显子是由PTB进行调节的，在高胆固醇血症时，组蛋白H3K36的三甲基化水平在缺失外显子周围水平升高，可与染色质结合蛋白(MRG15)结合，MRG15又可与PTB相连，通过PTB与剪接因子U2AF竞争结合3’剪接位点，从而影响外显子使其被切除，LDLR-?Exon4，LDLR-?Exon12，HMGCS1-?Exon2和HMGCR-Exon?13产物的比例将明显上升，各基因全长表达下降，从而不能有效地降低血胆固醇。简言之，组蛋白修饰可能在LDLR pre-mRNA的选择性剪接中发挥了重要作用。
, 百拇医药
本文通过RT-PCR检测高、低胆固醇模型组与正常组相比，LDLR-?Exon4、LDLR-?Exon12、HMGCS1-?Exon2和HMGCR-Exon?13等变异剪接体表达确实受胆固醇的影响，与高胆固醇血症有着密切关系，但是这些变化是否由于表观遗传修饰引起的，还需要进一步的研究。
参考文献
[1] Lu N，Li Y，Qin H，et al.Gossypin Up-Regulates LDL Receptor through Activation of ERK Pathway：A Signaling Mechanism for the Hypocholesterolemic Effect[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2008，56(23)：11526-11532., http://www.100md.com(庞亚娜 赵晋枫 董元坤)