翁吴斌 刘昌明 张家彬 李国敏 薛清平 林宁峰 陈光炳

    目前前列腺癌发病率为13.5%，位居男性全部恶性肿瘤第二位[1]，且随着人口老龄化，其发病率和病死率将逐年升高，对社会和家庭均造成巨大负担，因此寻找有效的治疗方案成了当务之急。RALA 作为RAL(Ras 相关性蛋白，Ras-like)家族的一员，其基因最早由类人猿RALA 基因序列中分离出来的，定位在人类7 号染色体上，其长度为84 642 bp[2]。相关研究数据显示RAL 家族蛋白在恶性肿瘤的生长、侵袭及转移等生物行为中起着至关重要的作用，在包括结肠癌、肺癌在内的多种肿瘤中都发现RAL 家族基因的表达改变[2]。另有研究表明，在多种肿瘤的生长中，RALA 作为癌基因起着关键性作用[3]。在前列腺癌的发生、发展中是否存在RALA 的参与目前尚不明确。因此本研究通过小干扰RNA 沉默前列腺癌DU145 细胞株中RALA 基因的表达来观察对DU145 细胞增殖、凋亡及迁移的影响，以及探讨可能机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料 人前列腺癌细胞株LNCap、PC-3 和DU145 购于中国科学院上海细胞库。PRMI1640 培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清均购于北京赛默飞世尔科技有限公司；链霉素、青霉素来源于山东鲁抗医药；PBS 缓冲液、细胞裂解液(RIPA)、RTPCR 试剂盒、Trizol 试剂购于杭州博日生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 购于Invitrogen 公司；Annexin V/PI 染色试剂、噻唑蓝比色法(MTT)盒均购自北京鼎国生物技术有限公司；未包被基质胶 的Transwell 小室美国Sigma 公 司；PCR 引物和RALA-siRNA 由上海生工生物工程有限公司合成，于-20 ℃下保存；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ECL试剂盒均购于碧云天生物技术研究所；山羊抗兔IgG 第二抗体、山羊抗鼠IgG、兔抗人RALA 多克隆抗体第二抗体购于英国Abcam 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 人前列腺癌LNCap、DU145 和PC-3 细胞，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液进行传代培养。每2～3 天更换一次培养液，维持培养液pH 值在7.2～7.4，当前列腺癌细胞以致密单层的形式平铺在培养瓶壁上后则用于传代，使用0.25%胰蛋白酶进行消化，实验用的前列腺癌细胞采用对数生长期细胞。

    1.2.2 RT-PCR 检测前列腺癌DU145、PC-3 和LNCap 细胞中RALA mRNA 的表达水平 收集对数生长期的DU145、PC-3 和LNCap 细胞 ......