范玉成，徐方晶，王 锐，何 军，3，景 丽

    (1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院，银川 750004；4.宁夏医科大学附属石嘴山市第一人民医院病理科，石嘴山 753000)

    过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR γ)是核受体超家族中的重要一员[1-3]。噻唑烷酮类化合物以及布洛芬、芬布芬等非甾体抗炎药物是PPAR γ 重要的人工合成配体[4-5]。有研究[6-8]发现，糖尿病患者发生心肌代谢紊乱与PPAR γ 激活及表达增强有关。泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(ubiquitin ligase muscle ring finger protein2，MuRF2)是近年发现的心肌横纹肌特异性泛素连接酶[9]。在心肌组织中，MuRF2 存在于心肌肌小节M线，与肌联蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白协同完成心肌细胞收缩活动，参与并调控心脏发育和舒缩功能[10]。本课题组前期研究[11-12]发现，MuRF2 通过泛素化方式修饰PPAR γ1，其缺失可能导致严重的糖尿病心肌病，而糖尿病心肌病是目前糖尿病患者死亡的一种常见原因[13-15]。关于MuRF2 通过泛素化方式修饰PPAR γ1 参与糖尿病心肌病发生的机制尚不清楚，仍需通过适当的载体进行相关研究。本文旨在构建PPAR γ1、MuRF2 和泛素(ubiquitin，Ub)的重组质粒，以HEK 293T 细胞为工具细胞进行共转染，检测PPAR γ1、MuRF2 和Ub 蛋白的表达及泛素化修饰作用，以期为探讨PPAR γ1 和MuRF2 泛素化修饰作用提供载体。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    GV146 载体和GV417 载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；大肠杆菌感受态细胞DH5α 由本实验室制作保存；HEK 293T 细胞由武汉普诺赛生命科技有限公司提供；GeneRuler 1 kb DNA Ladder 购自Thermo Scientific 公司；NormalRunTM250 bp-ⅡDNA Ladder 购自GeneRay公司；Restriction Endonuclease 购自NEB 公司；HS DNA Polymerase 购自TaKaRa 公司；Taq Plus DNA polymerase 和ClonExpressTMⅡOne Step Cloning Kit 购自Vazyme 公司；EndoFree midi Plasmid Kit 购自北京天根公司；质粒提取试剂盒购自Omega 公司；LipofectamineTM3000 Reagent购自Invitrogen 公司；DMEM 培养基和胎牛血清购自Gibco 公司；PBS 和胰酶购自BI 公司；全蛋白检测试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒和SDS-PAGE 快速凝胶配制试剂盒购于凯基生物公司；PPAR γ 抗体购自Cell Signaling Technology 公司；GAPDH 抗体购自博奥森公司；辣根过氧化酶标记的二抗购自北京天根公司；免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒购自爱必信公司；HA 抗体购自碧云天公司 ......