蛋白片段互补方法及其在药物筛选中的应用(2)
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2.2半乳糖苷酶大肠杆菌的p半乳糖苷酶(galactosidase)可以分割为△和△α片段，当分别与2个相互作用的蛋白融合表达时，蛋白间的相互作用诱导2个片段发生互补使半乳糖苷酶活性得到重组。Rossi[9]等首次用此法验证了纳巴霉素诱导的FKBP12/ FRAP复合体的形成。半乳糖苷酶片段的互补为检测哺乳动物细胞内蛋白质相互作用提供了一种快速、简便和灵敏的方法。该方法由于酶联反应能将其信号放大，可以通过生化、荧光及化学发光的检测进行定量[10,11]。但是这种方法不能进行体内实时检测，要裂解细胞体外检测酶活性，并且需要优化酶反应时间和底物数量，避免因酶底物反应时间太长产生的假阳性。
2.3β-内酰胺酶β-内酰胺酶(β-lactamase)是细菌产生的可水解β-内酰胺环抗生素的酶，从而导致细菌对β内酰胺类抗菌药物耐药。最常用于PCA的内酰胺酶是TEM-1β-lactamase。该酶是一个分子量仅为29 KD，含286个氨基酸的单体蛋白，具有分子量小、单体酶、容易表达、对细胞无毒以及没有真核细胞同源物等优点。在PCA中，重建后的内酰胺酶活性可将其红色底物头孢噻吩分解分解为黄色的物质，用分光光度计可证实该变化。另外，胞内的CCF2/AM 进入细胞膜，在胞质酯酶的作用下，释放内酰胺酶的底物CCF2。CCF2有两个发色基团，其中香豆素发色基团供体在409纳米的激发下，能将能量传递给受体发色基团，使其发出520 nm的绿色荧光。当内酰胺酶起作用时，它将CCF2水解，使两个发色基团分开，仍用409纳米光激发，发色基团供体和受体离得较远(>10 nm),供受体之间不能发生FRET，只发出供体自己的激发光(477 nm，蓝色)。内酰胺酶PCA分析的局限性在于其前底物CCF2/AM的出现在不同细胞是不等同的，甚至在许多情况下是完全不出现的(如植物和酵母细胞中)[12]。
2.4荧光素酶常用于PCA分析的荧光酶有萤火虫荧光素酶(irefly luciferase)和海肾荧光素酶(enilla luciferase)两种。R.Paulmurugan[13]等将合成的海肾荧光素酶在不同的位点进行切割 ......
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