TIMP-3基因在肝细胞肝癌中的表达及其意义(2)
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1.4.2逆转录合成cDNA反转录反应的体系为体系总体积取20 μl，各组分终浓度分别为逆转录缓冲液1X、dNTP 0.375 mmol/L、MMLV 逆转录酶20 U、总RNA样品0.2~ 200 ng， DEPC水加至20 μl，逆转录反应参数依次为为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min。
1.4.3荧光定量PCR反应反应体系总体积取20 μl，各组分浓度分别为PCR缓冲液1X(内含SYBR Green荧光染料)、特异引物0.08 μmol/L、Taq DNA聚合酶5 U/μl、逆转录产物2 μl，DEPC 水加至20 μl；PCR扩增条件为95 ℃变性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 个PCR 循环。所有反应均设立3个复孔。以2-△△CT表示肿瘤组织TIMP-3的表达量相对于对照组表达量的变化倍数，TIMP-3△△CT=(CT各自-CTβ-actin)肝癌(CT各自-CTβ-actin) 癌旁组织。
1.5免疫组化检测把4 μm 厚石蜡切片65 ℃烘烤脱蜡，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶5 min ，微波修复抗原，加一抗4 ℃湿盒中过夜，加生物素化二抗37 ℃反应30 min ，以辣根过氧化物酶标记链霉亲合素37 ℃处理30 min ，冲洗后加二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，脱水、封片后在光镜下观察，PTEN阳性表达部位主要在细胞质，凡细胞质中出现明显的棕黄色颗粒者为阳性细胞，TIMP-3的阳性表达部位主要在细胞外基质，凡细胞外基质质中出现明显的棕黄色斑片状为阳性细胞。
1.6统计学处理实时荧光定量PCR，TIMP-3的表达量相对表达数据以均数±标准差(x±s)表示，免疫组化的结果将采用Image-Pro Plus 5.0软件进行灰密度分析，数据均采用SPSS 13.0统计软件的t检验进行统计处理， P<0.05 为差异有统计学意义。2结果
2.1TIMP-3在HCC及癌旁组织中的表达肝癌组织中TIMP-3 mRNA相对表达量明显低于癌旁组织和正常肝组织中的TIMP-3相对表达量 ......
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