适体分子信标荧光共振能量转移法检测尿腺苷(2)
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参见附件。
采用经典的Frens法[7]制备金纳米粒子：100 ml 0.1 g/L的氯金酸加热至沸腾，迅速加入3.5 ml 10 g/L柠檬酸三钠，加热搅拌，15 min后移去热源，冷却至室温。
2.2 双链体准备及与金纳米粒子的偶联
将DNA1与DNA 2/3(100 μmol/L)按1∶4的比例混合，在0.1 mol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2 条件下，94 ℃变性2 min，55 ℃复性2 min，然后置于4 ℃冰箱中过夜，使DNA1复性完全。将复性好的双链体与上一步制备的金纳米粒子混合，在37 ℃水浴条件下反应8 h，加入PBS缓冲液，37 ℃水浴24 h，然后于12 000 r/min离心15 min，除去上清液，再加PBS缓冲液重新混悬，如此离心-重悬清洗两次，以除去剩余的DNA2和未结合的双链体，最后重悬于灭菌双蒸水中待用。
2.3 腺苷检测
在2 ml的EP管中，加入DNA1-GNPs复合物使腺苷适体(DNA1)的终浓度为1 μmol/L，及含150 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2和5 mmol/L KCl的Tris缓冲液(20 mmol/L，pH=7.4)，再加入不同体积的腺苷标准液，最后加入灭菌双蒸水使总体积为250 μl。置于45 ℃水浴箱中5 min，冷却至室温，测各管的荧光强度值。
3 实验原理
实验原理如图1所示，DNA1为腺苷适体序列[8]，在其3’端修饰了荧光基团(6-FAM)。DNA2为与DNA1完全互补的11个寡核苷酸序列，其5’端修饰了巯基。DNA3的序列与DNA2相同，只是其5’端修饰的是猝灭基团(DABCYL)，用来与金纳米粒子的猝灭效率作比较 ......
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