人ERCC1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建(2)
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参见附件。
2.2 质粒的构建
将PCR条带割胶回收的产物与质粒pGL4 Basic用限制性酶BglⅡ和KpnⅠ消化。消化后的质粒，分子量大小为6.1 kb；消化后的PCR产物，分子量大小为3 kb。图1B显示载体和PCR产物酶切后分子量大小与预期一致，证明酶切成功。酶切后载体与目的片段连接并转化后，PCR验证，挑取阳性克隆送公司测序鉴定。DNA测序结果显示序列及插入方向正确，说明已成功构建人ERCC1启动子荧光素酶报告基因载体，命名为PGL4-ERCC1-P1。
图1 人ERCC1启动子荧光素酶报告基因表达载体的构建
注：A中1为ERCC1启动子PCR扩增片段，M均为1 kb DNA Marker；B为酶切后片段，1为pGL4- Basic载体酶切后；2为pGL4 Basic载体未酶切；3为目的片段酶切后
3 讨论
铂类是目前治疗肺癌最常用的化疗药物之一，其作用机制是和DNA上的鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶结合，从而形成复合物，引发DNA链内或链间交联而损伤，最终导致肿瘤细胞死亡[3]。核苷酸剪切修复中重要的限速基因ERCC1，它位于19号染色体上 ......
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