探讨卵巢浆液性癌组织中Rap1蛋白表达及其在浆液性癌细胞增殖中的作用(1)
【摘要】 目的：探讨Rap1蛋白卵巢浆液性癌组织中的表达及其在浆液性癌细胞增殖中的作用。方法：对笔者所在医院2015年4月-2017年4月手术切除的卵巢标本资料实施统计分析，其中20份为浆液性卵巢癌组织标本，良性肿瘤组织标本10份。另对同期手术切除的正常卵巢组织标本10份的临床资料进行统计分析，进行细胞培养、Western blot检测，设计siRNA靶序列，构建靶向Rap1 的siRNA 真核表达载体，建立SKOV3-Rap1-RNAi稳定转染细胞株，进行MTT实验，然后对卵巢浆液性癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达、SKOV3细胞增殖受Rap1基因下调的影响进行分析。结果：卵巢浆液性癌组织中Rap1蛋白表达线显著高于良性肿瘤、正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)，但良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；Rap1组细胞的增殖速度显著高于Empty、WT、NT.Cont组细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，但Empty、WT、NT.Cont组细胞的增殖速度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：卵巢浆液性癌组织中Rap1蛋白表达较高，其会对浆液性癌细胞增殖进行抑制。
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【关键词】 卵巢浆液性癌组织； Rap1蛋白表达； 浆液性癌细胞增殖； 作用
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.25.028 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2017)25-0055-02
為了将浆液性癌细胞增殖中Rap1蛋白表达的作用阐明，本研究对卵巢浆液性癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达进行了比较，同时将Rap1 shRNA真核表达载体构建了起来，在此过程中将RNA干扰技术充分利用了起来，并建立了SKOV3-Rap1-RNAi稳定转染细胞株筛选，对SKOV3 细胞增殖能力(Rap1表达缺失)的变化进行检测，在此过程中运用MTT法，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 材料与试剂
对笔者所在医院2015年4月-2017年4月手术切除的卵巢标本的临床资料进行统计分析，纳入标准：所有患者均具有完整的临床病历资料。排除标准：将合并其他系统恶性肿瘤、术前接受放化疗治疗等卵巢癌患者排除在外。其中20份为液性卵巢癌组织标本，良性肿瘤组织标本10份。另对同期手术切除的正常卵巢组织标本10份的临床资料进行统计分析，所有标本均以子宫肌瘤为原发病。切除离体后的标本第一时间放置在液氮中保存备用。病理科医师阅片对所有标本的病理诊断进行证实。采用笔者所在医院实验研究中心提供的感受态宿主菌大肠杆菌DH-5α，购买美国Oligo-engine公司生产的pSUPER.retro.neo/GFP(Empty)真核表达载体，GFP、Neo、Amp分别为绿色荧光标记、真核筛选基因(G418)、氨苄抗性基因。EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ为酶切位点，含H1启动子。购买重庆医科大学病理学教研室提供的卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3。本课题组在前期工作中已经将阴性质粒(NT)、空载体(Empty)建立了起来。购买宝生物工程(大连) 有限公司生产的限制性内切酶EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ、兔抗Rap1单克隆抗体，美国Invitrogen公司生产的脂质体LipofectamineTM2000，美国Progema公司生产的T4DNA连接酶，HyClone公司生产的胎牛血清、RPM1640培养基。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 常规培养SKOV3-Rap1-RNAi 稳定转染细胞株(Rap1i-1)、SKOV3细胞野生型(WT)、阴性质粒(NT.cont)、空载体(Empty)转染细胞株，位置为RPM1640培养基，实验细胞呈对数生长[1]。
1.2.2 Western blot检测 将总蛋白提取出来，途径为对各组组织及细胞进行裂解，然后对蛋白浓度进行测定，然后进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)前将60μg总蛋白从每个上样孔取出来，转膜，ECI显色前孵育，孵育过程中将抗体充分利用起来。成像过程中将凝胶成像仪充分利用起来，然后将各组蛋白条带的灰度值计算出来，计算过程中将Quantity One图像分析软件充分利用起来。蛋白相对表达量=蛋白条带的灰度值/内参灰度值[2]。
1.2.3 设计siRNA靶序列 对人Rap1基因全序列(NM_001010935.1)全长序列进行检索，检索过程中将GenBank充分利用起来，将3对Rap1 siRNA序列设计出来，Rap1 shRNA1基因序列为5’-GATCCCCTGCCAACAGTGTATGCTCGTTCAAGAGACGAGCATACACTGTTGGCATTTTTGGAAA-3’，Rapl shRNA2基因序列为5’-GATCCCCGATGAGCGAGTAGTTGGCATTCAAGAGATGCC-AACTACTCGCTCATCTTTTTGGAAA-3’，Rapl shRNA3基因序列为5’GATCCCCAGTGGTGTAACTGTGCCTTTTCAAGAGAAAGGCACAGTTACACCACTTTTTTGGAAA-3’。其含19 nt，设计过程中将Oligoengine RNAi设计软件充分利用起来，并对siRNA设计原则进行严格遵循，合成主体为invitrogen[3]。
1.2.4 构建靶向Rap1 的siRNA 真核表达载体 将正义链、反义链退火，其由化学合成，将良好的前提条件提供给shRNA表达模板的形成，连接pSUPER.retro.neo/GFP 质粒，其经BglⅡ、HindⅢ双酶切后线性化，然后向感受态宿主菌大肠杆菌DH-5α转化，将质粒提取出来，双酶切重组质粒，在此过程中将限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ充分利用起来，37 ℃水浴4 h，之后电泳分析，在此过程中将1%琼脂糖凝胶充分利用起来。向invitrogen送往进行DNA测序鉴定前保证质粒经双酶切鉴定成功[4]。, http://www.100md.com(侯祥位 陈立侠)
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【关键词】 卵巢浆液性癌组织； Rap1蛋白表达； 浆液性癌细胞增殖； 作用
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.25.028 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2017)25-0055-02
為了将浆液性癌细胞增殖中Rap1蛋白表达的作用阐明，本研究对卵巢浆液性癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达进行了比较，同时将Rap1 shRNA真核表达载体构建了起来，在此过程中将RNA干扰技术充分利用了起来，并建立了SKOV3-Rap1-RNAi稳定转染细胞株筛选，对SKOV3 细胞增殖能力(Rap1表达缺失)的变化进行检测，在此过程中运用MTT法，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 材料与试剂
对笔者所在医院2015年4月-2017年4月手术切除的卵巢标本的临床资料进行统计分析，纳入标准：所有患者均具有完整的临床病历资料。排除标准：将合并其他系统恶性肿瘤、术前接受放化疗治疗等卵巢癌患者排除在外。其中20份为液性卵巢癌组织标本，良性肿瘤组织标本10份。另对同期手术切除的正常卵巢组织标本10份的临床资料进行统计分析，所有标本均以子宫肌瘤为原发病。切除离体后的标本第一时间放置在液氮中保存备用。病理科医师阅片对所有标本的病理诊断进行证实。采用笔者所在医院实验研究中心提供的感受态宿主菌大肠杆菌DH-5α，购买美国Oligo-engine公司生产的pSUPER.retro.neo/GFP(Empty)真核表达载体，GFP、Neo、Amp分别为绿色荧光标记、真核筛选基因(G418)、氨苄抗性基因。EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ为酶切位点，含H1启动子。购买重庆医科大学病理学教研室提供的卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3。本课题组在前期工作中已经将阴性质粒(NT)、空载体(Empty)建立了起来。购买宝生物工程(大连) 有限公司生产的限制性内切酶EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ、兔抗Rap1单克隆抗体，美国Invitrogen公司生产的脂质体LipofectamineTM2000，美国Progema公司生产的T4DNA连接酶，HyClone公司生产的胎牛血清、RPM1640培养基。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 常规培养SKOV3-Rap1-RNAi 稳定转染细胞株(Rap1i-1)、SKOV3细胞野生型(WT)、阴性质粒(NT.cont)、空载体(Empty)转染细胞株，位置为RPM1640培养基，实验细胞呈对数生长[1]。
1.2.2 Western blot检测 将总蛋白提取出来，途径为对各组组织及细胞进行裂解，然后对蛋白浓度进行测定，然后进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)前将60μg总蛋白从每个上样孔取出来，转膜，ECI显色前孵育，孵育过程中将抗体充分利用起来。成像过程中将凝胶成像仪充分利用起来，然后将各组蛋白条带的灰度值计算出来，计算过程中将Quantity One图像分析软件充分利用起来。蛋白相对表达量=蛋白条带的灰度值/内参灰度值[2]。
1.2.3 设计siRNA靶序列 对人Rap1基因全序列(NM_001010935.1)全长序列进行检索，检索过程中将GenBank充分利用起来，将3对Rap1 siRNA序列设计出来，Rap1 shRNA1基因序列为5’-GATCCCCTGCCAACAGTGTATGCTCGTTCAAGAGACGAGCATACACTGTTGGCATTTTTGGAAA-3’，Rapl shRNA2基因序列为5’-GATCCCCGATGAGCGAGTAGTTGGCATTCAAGAGATGCC-AACTACTCGCTCATCTTTTTGGAAA-3’，Rapl shRNA3基因序列为5’GATCCCCAGTGGTGTAACTGTGCCTTTTCAAGAGAAAGGCACAGTTACACCACTTTTTTGGAAA-3’。其含19 nt，设计过程中将Oligoengine RNAi设计软件充分利用起来，并对siRNA设计原则进行严格遵循，合成主体为invitrogen[3]。
1.2.4 构建靶向Rap1 的siRNA 真核表达载体 将正义链、反义链退火，其由化学合成，将良好的前提条件提供给shRNA表达模板的形成，连接pSUPER.retro.neo/GFP 质粒，其经BglⅡ、HindⅢ双酶切后线性化，然后向感受态宿主菌大肠杆菌DH-5α转化，将质粒提取出来，双酶切重组质粒，在此过程中将限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ充分利用起来，37 ℃水浴4 h，之后电泳分析，在此过程中将1%琼脂糖凝胶充分利用起来。向invitrogen送往进行DNA测序鉴定前保证质粒经双酶切鉴定成功[4]。, http://www.100md.com(侯祥位 陈立侠)