产前诊断检测技术的新进展(1)
【摘要】 产前诊断是指对胎儿进行先天性缺陷和遗传性疾病的诊断，是防控出生缺陷及提高人口素质的主要手段。产前诊断实验室检测方法多样，从20世纪60年代的染色体核型分析发展到现在的基因测序技术，各种产前诊断实验室检测技术各有优缺点。现就产前诊断实验室检测技术的进展及各产前诊断实验室检测技术的特点展开综述。
【关键词】 产前诊断; 染色体核型分析; 基因测序
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.13.084 文献标识码 A 文章编号 1674-6805(2019)13-0-04
近年来随着高龄妊娠人数和环境污染的增加，出生缺陷的发生率在逐年上升。产前诊断可以有效地预防出生缺陷的发生，所以产前诊断越来越受到社会各界的重视。产前诊断技术是为了尽量控制出生缺陷，而通过各种方法检测胎儿出生前患某种遗传性疾病或先天畸形与否。产前诊断实验室检测技术主要包括：(1)染色体核型分析;(2)分子细胞遗传学分析技术：荧光原位杂交(FISH)、微阵列芯片杂交技术等;(3)PCR;(4)多重连接依赖式探针扩增;(5)基因测序技术：一代测序、二代测序、三代测序、正在研究的四代测序技术等。各种产前诊断实验室检测技术各有优缺点，下面笔者逐一展开叙述。
1 染色体核型分析
自20世纪60年代开始染色体核型分析技术已作为临床上进行产前诊断染色体异常的金标准，常染色体核型分析技术在产前诊断中有G、Q、R、C、N等显带技术，可根据不同的需求来选择。G带带型比较稳定，是最常使用的人类染色体核型分析检测显带技术。目前鉴别G显带核型标准仍然是由人类细胞遗传命名国际体系规定的，检测的染色体是通过与其比对来判定改变与否。临床上常见的遗传病及染色体突变通过G显带核型分析技术来检测准确可靠，该技术应用广泛。为降低出生缺陷、提高出生人口素质，目前我国采用对所有孕妇进行早、中孕期的筛查，对筛查高危者再进行染色体核型分析产前诊断来进一步确诊[1-3]。所以G显带核型分析技术对提高出生人口素质有重要的意义。G显带核型分析可检测>5 Mb的染色体片段结构异常，且具有准确性高，经济实惠等优点。但染色体核型分析无法检测微小变异及缺失。
2 分子细胞遗传学分析技术(包括FISH技术和微阵列芯片杂交技术)
FISH技术是遵循碱基互补的原则，用标记后的DNA作探针，然后与载玻片上待测的DNA互补链进行杂交，然后检测杂交位点荧光判读染色体突变。FISH可直接检测没有经过细胞培养的标本是其最大的优点，最短可在1 h后直接给出诊断。FISH可避免污染，可分析间期细胞，因此其培养失败率低及培养时间短，检测时间亦缩短。FISH检测已知染色体异常较染色体核型分析准确。FISH 技术应用于产前诊断不仅可以加快产前诊断的速度，而且准确性高[4-5]，还可以延长胎儿羊水染色体检查在产前诊断中的时间窗。但FISH 因探针数目有限，只能对少数已知染色体异常进行诊断。
微阵列芯片杂交技术是在全基因组范围内检测染色体的微缺失和微重复，且分辨率高的一种检测技术。它由单核苷酸多态微阵列(SNParray)和比较基因组杂交微阵列(aCGH)组成。SNParray是在基因组水平上通过微阵列检出单个核苷酸的变异的，aCGH 是通过微阵列检出与疾病相关的染色体异常。微阵列芯片杂交技术与前述2个检测技术相比具有通量高、分辨率高和自动化检测高的优势，可以一次性同时检测许多与出生缺陷和先天性疾病相关的基因组异常，近年来已经广泛应用于存在胎儿结构异常的侵入性产前诊断[6-7]。有学者证明了微阵列芯片杂交技术在检测胎儿染色体重组方面的效率，它显著提高了结构性缺陷胎儿的检出率[8]。但微阵列芯片杂交技术只能检测染色体数目重复或缺失，不能检测染色体的结构异常，价格较昂贵。它的适应证是胎儿结构异常，且最好先行染色体核型分析检查。
3 PCR技术
PCR技术是针对人类染色体上具有多态性的短串联重复序列而扩增的，检测出常见的染色体数目异常的时间可短至几小时内，其特点是快速、准确、成本低、敏感性高、特异性高等优点，但其即使结果正常也不能排除染色体畸形，且不能检测染色体嵌合体及易位型，这些限制了其在产前诊断中的应用。但基因一代测序却离不开PCR技术的辅助作用。
4 多重连接依赖式探针扩增技术
多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术是基于 PCR 的一种检测技术，可同时检测多达50个DNA序列拷贝数的变化。是对DNA序列进行定性及半定量分析的方法，主要用于大缺失、重复的检测，但无法同时针对整个外显子的DNA序列进行检测。故临床上对明确致病基因的遗传病可用MLPA技术进行产前诊断[9-10]。
5 基因测序技术
基因测序技术是核酸DNA分子一级结构的测定。应用广泛、发展迅速，已经从第一代发展到第四代。第一代测序技术测序准确性高，但通量较低，成本相对较高;第二代测序技术测序通量大大提高，是目前临床上常用的基因测序方法;第三代测尚待完善;第四代测序技术还在实验阶段。
5.1 第一代测序(包括化学裂解法、Sanger测序)
化学裂解法是基于PCR的DNA测序法进行的，其原理是：先处理有标记的DNA片段，然后特异性切割，并且产生降解产物，再经过电泳和放射自显影之后可读出相应片段DNA的核苷酸序列。此方法為最早的基因测序方法，但其操作复杂，且读取片段短，目前很少应用。
Sanger测序的原理是利用DNA聚合酶以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物设立四种相互独立的测序反应体系，给每个反应体系中加入不同ddNTP作为链延伸终止剂。虽然Sanger法的弊端有：离不开PCR扩增，只能分析单个DNA片段，通量小;自动化程度低，检测速度慢;成本相对较高[11]。但Sanger测序准确性高，目前仍是基因分型的金标准。目前Sanger测序广泛应用于全基因组测序及全外显子测序的假阳性验证方面。对已明确致病基因的遗传性单基因疾病也可使用Sanger测序进行产前诊断[12-13]。, 百拇医药(杨冬艳 庞丽红)
【关键词】 产前诊断; 染色体核型分析; 基因测序
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.13.084 文献标识码 A 文章编号 1674-6805(2019)13-0-04
近年来随着高龄妊娠人数和环境污染的增加，出生缺陷的发生率在逐年上升。产前诊断可以有效地预防出生缺陷的发生，所以产前诊断越来越受到社会各界的重视。产前诊断技术是为了尽量控制出生缺陷，而通过各种方法检测胎儿出生前患某种遗传性疾病或先天畸形与否。产前诊断实验室检测技术主要包括：(1)染色体核型分析;(2)分子细胞遗传学分析技术：荧光原位杂交(FISH)、微阵列芯片杂交技术等;(3)PCR;(4)多重连接依赖式探针扩增;(5)基因测序技术：一代测序、二代测序、三代测序、正在研究的四代测序技术等。各种产前诊断实验室检测技术各有优缺点，下面笔者逐一展开叙述。
1 染色体核型分析
自20世纪60年代开始染色体核型分析技术已作为临床上进行产前诊断染色体异常的金标准，常染色体核型分析技术在产前诊断中有G、Q、R、C、N等显带技术，可根据不同的需求来选择。G带带型比较稳定，是最常使用的人类染色体核型分析检测显带技术。目前鉴别G显带核型标准仍然是由人类细胞遗传命名国际体系规定的，检测的染色体是通过与其比对来判定改变与否。临床上常见的遗传病及染色体突变通过G显带核型分析技术来检测准确可靠，该技术应用广泛。为降低出生缺陷、提高出生人口素质，目前我国采用对所有孕妇进行早、中孕期的筛查，对筛查高危者再进行染色体核型分析产前诊断来进一步确诊[1-3]。所以G显带核型分析技术对提高出生人口素质有重要的意义。G显带核型分析可检测>5 Mb的染色体片段结构异常，且具有准确性高，经济实惠等优点。但染色体核型分析无法检测微小变异及缺失。
2 分子细胞遗传学分析技术(包括FISH技术和微阵列芯片杂交技术)
FISH技术是遵循碱基互补的原则，用标记后的DNA作探针，然后与载玻片上待测的DNA互补链进行杂交，然后检测杂交位点荧光判读染色体突变。FISH可直接检测没有经过细胞培养的标本是其最大的优点，最短可在1 h后直接给出诊断。FISH可避免污染，可分析间期细胞，因此其培养失败率低及培养时间短，检测时间亦缩短。FISH检测已知染色体异常较染色体核型分析准确。FISH 技术应用于产前诊断不仅可以加快产前诊断的速度，而且准确性高[4-5]，还可以延长胎儿羊水染色体检查在产前诊断中的时间窗。但FISH 因探针数目有限，只能对少数已知染色体异常进行诊断。
微阵列芯片杂交技术是在全基因组范围内检测染色体的微缺失和微重复，且分辨率高的一种检测技术。它由单核苷酸多态微阵列(SNParray)和比较基因组杂交微阵列(aCGH)组成。SNParray是在基因组水平上通过微阵列检出单个核苷酸的变异的，aCGH 是通过微阵列检出与疾病相关的染色体异常。微阵列芯片杂交技术与前述2个检测技术相比具有通量高、分辨率高和自动化检测高的优势，可以一次性同时检测许多与出生缺陷和先天性疾病相关的基因组异常，近年来已经广泛应用于存在胎儿结构异常的侵入性产前诊断[6-7]。有学者证明了微阵列芯片杂交技术在检测胎儿染色体重组方面的效率，它显著提高了结构性缺陷胎儿的检出率[8]。但微阵列芯片杂交技术只能检测染色体数目重复或缺失，不能检测染色体的结构异常，价格较昂贵。它的适应证是胎儿结构异常，且最好先行染色体核型分析检查。
3 PCR技术
PCR技术是针对人类染色体上具有多态性的短串联重复序列而扩增的，检测出常见的染色体数目异常的时间可短至几小时内，其特点是快速、准确、成本低、敏感性高、特异性高等优点，但其即使结果正常也不能排除染色体畸形，且不能检测染色体嵌合体及易位型，这些限制了其在产前诊断中的应用。但基因一代测序却离不开PCR技术的辅助作用。
4 多重连接依赖式探针扩增技术
多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术是基于 PCR 的一种检测技术，可同时检测多达50个DNA序列拷贝数的变化。是对DNA序列进行定性及半定量分析的方法，主要用于大缺失、重复的检测，但无法同时针对整个外显子的DNA序列进行检测。故临床上对明确致病基因的遗传病可用MLPA技术进行产前诊断[9-10]。
5 基因测序技术
基因测序技术是核酸DNA分子一级结构的测定。应用广泛、发展迅速，已经从第一代发展到第四代。第一代测序技术测序准确性高，但通量较低，成本相对较高;第二代测序技术测序通量大大提高，是目前临床上常用的基因测序方法;第三代测尚待完善;第四代测序技术还在实验阶段。
5.1 第一代测序(包括化学裂解法、Sanger测序)
化学裂解法是基于PCR的DNA测序法进行的，其原理是：先处理有标记的DNA片段，然后特异性切割，并且产生降解产物，再经过电泳和放射自显影之后可读出相应片段DNA的核苷酸序列。此方法為最早的基因测序方法，但其操作复杂，且读取片段短，目前很少应用。
Sanger测序的原理是利用DNA聚合酶以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物设立四种相互独立的测序反应体系，给每个反应体系中加入不同ddNTP作为链延伸终止剂。虽然Sanger法的弊端有：离不开PCR扩增，只能分析单个DNA片段，通量小;自动化程度低，检测速度慢;成本相对较高[11]。但Sanger测序准确性高，目前仍是基因分型的金标准。目前Sanger测序广泛应用于全基因组测序及全外显子测序的假阳性验证方面。对已明确致病基因的遗传性单基因疾病也可使用Sanger测序进行产前诊断[12-13]。, 百拇医药(杨冬艳 庞丽红)