干扰S100A4在屋尘螨诱导的哮喘气道上皮屏障功能的作用(2)
1 材料与方法1.1 一般材料
人正常气道上皮细胞16HBE细胞(中国科学院上海生命科学研究院提供)在培养瓶中生长密度达90%左右时,胰酶[吉诺生物科技有限公司(中国)提供]消化后移至6孔板中,分为空白对照组(无转染,con组)、转染空白序列组(NC组),S100A4干扰组(转染S100A4序列,S100A4-siRNA组)。
1.2 方法
(1)各组均进行脂质体转染,S100A4干扰碱基序列及阴性对照干扰序列由美国Ambion公司提供[8],正义链:5’ GGACAAGGCCCGUUAUGAA dTdT 3’,反义链:3’ dTdT CCUGUUCCGGGCAAUACUU 5’,等细胞生长至整个板表面积60%左右时进行转染。Lipofectamine TM2000(美国Thermo scientific公司)5 μl+无血清的RPMI(美国GIBCO公司)245 μl混匀稀释,室温孵育5 min,再取S100A4-siRNA或阴性对照siRNA序列75 pmol(250 μl),加入上述稀释液中等混匀 ......
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