1.2 方法

    1.2.1 标本制备 结肠癌手术标本，肠管切开，中性福尔马林充分固定24 h，分别取肿瘤组织、近端1、2、3 cm处的组织以及远端1、2、3 cm处的组织，以及距肿瘤8 cm处的正常肠壁组织，共8处作为标本，经常规脱水、包埋，制成石蜡组织保存。

    1.2.2 组织总RNA提取 使用QIAGEM公司FFPE RNA提取试剂盒提取RNA，紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。

    1.2.3 cDNA逆转录 使用Promega公司逆转录酶进行逆转录：取2 μl RNA样品在70 ℃保温10 min，随后加入25 mmol/L MgCl2，4 μl;10X逆转录酶2 μl;10 mmol/L dNTP 2 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，Oligo(dT)2 μl;AMV逆转录酶15 U，补加DEPC水至总体积20 μl;42 ℃保温15 min，逆转录反应，合成cDNA第一链。反应后，99 ℃ 5 min灭活逆转录酶。

    1.2.4 实时荧光定量PCR 相对定量的内参基因是管家基因(β-actin)，各基因的引物和探针序列如下：β-actin：上游5’-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3’，下游5’-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’ ......