原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF表达分析(1)
【摘 要】本文目的在于对原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190和LIF表达进行分析，以了解其对妊娠建立的可能影响。本文成功地建立了血sgp190双抗体夹心ELISA测定法。原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF浓度表达异常，sgp190可能对人体整个循环中LIF表达具有负调节作用，从而影响胚泡着床而造成不孕。
【关键词】白血病抑制因子；可溶性gp190；酶联免疫吸附实验；胚泡着床
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 实验材料
LIF ELISA检测试剂盒(R&D Systems)、抗gp190胞外区抗体由晶美公司提供。抗sgp190多克隆抗体、sgp190亲和纯化品由本研究室制备[ 1]。
, 百拇医药
1.1.2研究对象
实验组：17例不明原因原发不孕症患者来源于重庆医科大学附属第一医院，平均年龄28.6士3.7年，不孕年限3～10年，平均3.56士0.89年。
纳入标准：年龄≦35岁，不孕年限>3年，月经周期28～30天，基础体温双相，高温相≥12天，分泌中期血孕酮≥32nmol/L，血PRL正常， 基础内分泌正常，夫妇双方染色体核型正常，抗精子抗体阴性，宫腔镜检查子宫正常，腹腔镜检查为正常盆腔，子宫、输卵管外观正常，6个月内未用过激素类药物，男方精液检查正常。
对照组：19例，平均年龄27.7士4.8年，纳入标准：除继往有正常生育史外，其它同实验组。
试验得到受试者知情同意。
1.2 方 法
, 百拇医药
1.2.1 双抗体夹心sgp190 ELISA检测的建立及方法学鉴定
1.2.1.1 HRP标记抗体的制备：见文献常规方法，用改良碘酸钠法标记亲和层析纯化抗sgp190多克隆抗体。
1.2.1.2双抗体夹心ELISA法的建立与双抗体工作浓度的确定(采用方阵滴定法)
以包被缓冲液稀释抗gp190胞外区部分McAb 至浓度为1、2、4、6μg/ ml，分别在酶标板上进行包被过夜。洗涤3次。在各孔中加入封闭液，37 ℃保温2 h ，洗涤3 次。在各孔中分别加入gp190 抗原液5μg/ ml，37 ℃保温2 h，洗涤3 次。加入系列稀释的酶标抗体兔抗人sgp190(稀释度为1：500-1：3000)100?l，37℃下孵育l h，洗涤5 次。在各孔中加入HRP-羊抗兔IgG抗体，1/ 10000 稀释，100μl/ 孔，37 ℃保温1 h，洗涤6 次。加底物显色。加2mol/ L H2SO4 终止反应后，读取OD450 nm 值。以OD450 nm 值为1 左右的条件作最佳条件，以此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。
, http://www.100md.com
1.2.1.3建立标准曲线
以确定浓度的抗人sgp190 McAb包被酶标板，加稀释的标准抗原0.5- 100ng/ml (10 ?g / ml的标准抗原4?l，加396 ?l稀释液成100 ng/ml，然后倍比稀释成0.5- 50ng/ml)。不同浓度的标准品都设四个平行测定孔，37 ℃1 h，洗3 次；加入稀释的兔抗人sgp190抗体100μl / 孔，37 ℃ 1 h，洗3 次；加入确定稀释度的HRP-羊抗兔IgG抗体100μl / 孔，37 ℃ 1 h，洗3 次；加底物溶液100μl / 孔。37 ℃避光反应10～15 min，2 mol / L H2SO4 终止反应，酶标仪450 nm处读取OD 值。以标准抗原( ng / ml) 为横坐标，相应OD值为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.1.4 检测方法准确性分析(回收实验，Recovery assay)
在已知sgp190 浓度的血浆中加入不同浓度的sgp190标准液，用已建立的ELISA方法测回收率。
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1.2.1.5检测方法精确度分析
取3 份血浆标本，做批内和批间测定，计算CV，分析制备sgp190 ELISA检测方法的精确度。
1.2.1.6健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期(月经周期第19～21d)血浆sgp190浓度测定
按上述标准曲线，利用建立的ELISA法测定健康女性与不孕患者植入窗口期血浆中sgp190浓度，每个样本作2个复孔。
1.2.2 健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期(月经周期的第19～21天)血浆LIF浓度测定
LIF ELISA检测试剂盒灵敏度8 pg /ml ，批内CV < 2.5 % 批间CV < 7.1 % ，回收率102%，具体操作步骤按说明书进行。
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1.2.3 统计学处理
实验结果用mean±SD表示，用 SPSS 10.0软件进行统计学分析，P<0.05 视为差异具统计学显著性意义。
2 结果
2.1 sgp190 ELISA检测酶标抗体与包被抗体最适工作浓度
方阵滴定结果显示，酶标抗体最适稀释度为1：500，包被抗体最适浓度为2?g/ml；在此工作浓度下检测浓缩血清、原倍血清及稀释1/2、1/4的血清样品，发现多数原倍血清的OD值都落在标准曲线之内。故选用原倍血样检测sgp190，如果某些原倍样品的OD值落在标准曲线之外时，改用浓缩血样或稀释血样检测。
2.2 sgp190测定标准曲线
在1.56 - 50ng /ml区间抗原浓度与OD值具有良好线性相关：OD450=0.019106·sgp190+0.288535，r= 0.971325。50ng /ml以上曲线趋饱和，1.563ng/ml以下的 OD值接近空白对照孔，检测灵敏度为1.56ng/ml。根据血样的 OD值，查标准曲线得相应的sgp190浓度。, http://www.100md.com(蒋康 黎刚 王应雄)
【关键词】白血病抑制因子；可溶性gp190；酶联免疫吸附实验；胚泡着床
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 实验材料
LIF ELISA检测试剂盒(R&D Systems)、抗gp190胞外区抗体由晶美公司提供。抗sgp190多克隆抗体、sgp190亲和纯化品由本研究室制备[ 1]。
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1.1.2研究对象
实验组：17例不明原因原发不孕症患者来源于重庆医科大学附属第一医院，平均年龄28.6士3.7年，不孕年限3～10年，平均3.56士0.89年。
纳入标准：年龄≦35岁，不孕年限>3年，月经周期28～30天，基础体温双相，高温相≥12天，分泌中期血孕酮≥32nmol/L，血PRL正常， 基础内分泌正常，夫妇双方染色体核型正常，抗精子抗体阴性，宫腔镜检查子宫正常，腹腔镜检查为正常盆腔，子宫、输卵管外观正常，6个月内未用过激素类药物，男方精液检查正常。
对照组：19例，平均年龄27.7士4.8年，纳入标准：除继往有正常生育史外，其它同实验组。
试验得到受试者知情同意。
1.2 方 法
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1.2.1 双抗体夹心sgp190 ELISA检测的建立及方法学鉴定
1.2.1.1 HRP标记抗体的制备：见文献常规方法，用改良碘酸钠法标记亲和层析纯化抗sgp190多克隆抗体。
1.2.1.2双抗体夹心ELISA法的建立与双抗体工作浓度的确定(采用方阵滴定法)
以包被缓冲液稀释抗gp190胞外区部分McAb 至浓度为1、2、4、6μg/ ml，分别在酶标板上进行包被过夜。洗涤3次。在各孔中加入封闭液，37 ℃保温2 h ，洗涤3 次。在各孔中分别加入gp190 抗原液5μg/ ml，37 ℃保温2 h，洗涤3 次。加入系列稀释的酶标抗体兔抗人sgp190(稀释度为1：500-1：3000)100?l，37℃下孵育l h，洗涤5 次。在各孔中加入HRP-羊抗兔IgG抗体，1/ 10000 稀释，100μl/ 孔，37 ℃保温1 h，洗涤6 次。加底物显色。加2mol/ L H2SO4 终止反应后，读取OD450 nm 值。以OD450 nm 值为1 左右的条件作最佳条件，以此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。
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1.2.1.3建立标准曲线
以确定浓度的抗人sgp190 McAb包被酶标板，加稀释的标准抗原0.5- 100ng/ml (10 ?g / ml的标准抗原4?l，加396 ?l稀释液成100 ng/ml，然后倍比稀释成0.5- 50ng/ml)。不同浓度的标准品都设四个平行测定孔，37 ℃1 h，洗3 次；加入稀释的兔抗人sgp190抗体100μl / 孔，37 ℃ 1 h，洗3 次；加入确定稀释度的HRP-羊抗兔IgG抗体100μl / 孔，37 ℃ 1 h，洗3 次；加底物溶液100μl / 孔。37 ℃避光反应10～15 min，2 mol / L H2SO4 终止反应，酶标仪450 nm处读取OD 值。以标准抗原( ng / ml) 为横坐标，相应OD值为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.1.4 检测方法准确性分析(回收实验，Recovery assay)
在已知sgp190 浓度的血浆中加入不同浓度的sgp190标准液，用已建立的ELISA方法测回收率。
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1.2.1.5检测方法精确度分析
取3 份血浆标本，做批内和批间测定，计算CV，分析制备sgp190 ELISA检测方法的精确度。
1.2.1.6健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期(月经周期第19～21d)血浆sgp190浓度测定
按上述标准曲线，利用建立的ELISA法测定健康女性与不孕患者植入窗口期血浆中sgp190浓度，每个样本作2个复孔。
1.2.2 健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期(月经周期的第19～21天)血浆LIF浓度测定
LIF ELISA检测试剂盒灵敏度8 pg /ml ，批内CV < 2.5 % 批间CV < 7.1 % ，回收率102%，具体操作步骤按说明书进行。
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1.2.3 统计学处理
实验结果用mean±SD表示，用 SPSS 10.0软件进行统计学分析，P<0.05 视为差异具统计学显著性意义。
2 结果
2.1 sgp190 ELISA检测酶标抗体与包被抗体最适工作浓度
方阵滴定结果显示，酶标抗体最适稀释度为1：500，包被抗体最适浓度为2?g/ml；在此工作浓度下检测浓缩血清、原倍血清及稀释1/2、1/4的血清样品，发现多数原倍血清的OD值都落在标准曲线之内。故选用原倍血样检测sgp190，如果某些原倍样品的OD值落在标准曲线之外时，改用浓缩血样或稀释血样检测。
2.2 sgp190测定标准曲线
在1.56 - 50ng /ml区间抗原浓度与OD值具有良好线性相关：OD450=0.019106·sgp190+0.288535，r= 0.971325。50ng /ml以上曲线趋饱和，1.563ng/ml以下的 OD值接近空白对照孔，检测灵敏度为1.56ng/ml。根据血样的 OD值，查标准曲线得相应的sgp190浓度。, http://www.100md.com(蒋康 黎刚 王应雄)