Smurf2在小管上皮细胞转分化中的表达及MG—132对其的影响(2)
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[Key words] proximal tubular cells;TGF-?1;Smurf2;MG-132
肾间质纤维化几乎是所有肾脏疾病发展的最终结局，肾小管上皮细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition EMT)是其关键步骤，表现为细胞极性消失，表达间充质细胞标记物α--平滑肌肌动蛋白(α-SMA),同时失去上皮细胞标记物E-钙依赖蛋白(E-cadherin)和角质蛋白(cytokeratin)。TGF-?1是多效能细胞因子，是EMT的关键因子，TGF-?1/Smad信号活性亢进在其过程中发挥了重要作用[1-3]。Smad 泛素化调节因子 2(Smad ubiquitin regulatory factor2,Smurf2)是 E3 泛素蛋白质连接酶家族的成员，因其特异性底物识别功能，在调节TGF-β1/-Smads信号通路中起关键的作用[4]。本研究观察Smurf2在TGF-?1致人近端小管上皮细胞(HK2)转分化中的表达变化，Smurf2对TGF-β1/Smads信号途径介质的作用及泛素蛋白酶体阻断剂MG-132对其干预后表达的影响，为小管间质纤维化的防治寻找新的策略。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与设备 实验用人近端小管上皮细胞株(HK2)由北京协和医院赠予。1：50鼠抗人α—SMA单克隆抗体及SP试剂盒购自福州迈新公司。抗SnoN抗体购置Santa Cruz公司，抗phospho-Smad2/3、Smad2/3抗体，Cell Signaling,US。固体MG-132，购自ALEXIS公司,UK。Western-blot主要试剂及提取总RNA的Trizol购自广州威佳公司。随机引物和MMLV逆转录酶、RNA酶抑制、2.0mMdNTP、TaqDNA聚合酶、DNA MARKER、PCR引物，购自上海生工公司。仪器Western-blot 电泳仪，BIO-RAD,美国。荧光显微镜来自ZEISS，德国。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 方法参考文献[13]
1.2.2 试验分组 体外培养的人近端小管上皮细胞分为4组：对照组(正常人近端小管上皮细胞)、TGF-?1(5ng/ml)组、TGF-?1(5ng/ml)+ MG-132 (UPP阻断剂，2.5umol/ml)组和MG-132 (2.5umol/ml)组。
1.2.3 免疫荧光 采用SP二步法，具体步骤严格按照试剂盒说明书，荧光显微镜下阅片。实验重复3次。
1.2.4 Western blot检测 方法见参考文献[13]，凝胶成像及分析系统分析蛋白显色的吸光度值。实验重复3次。
1.2.5 RT-PCR扩增 Trizol一步法提取细胞总RNA，引物由上海生工合成。基本参数如下。
取PCR产物3μl，PCRMarker作对照，1.2%琼脂糖凝胶上电泳45分钟，电泳条件：120V恒压，紫外透射仪上观察结果。一次性成像系统拍照，软件定量分析，实验重复3次。
1.3 统计学分析 实验数据以均数±标准差( )表示。所有数据经医学统计软件包SPSS(12.0版)处理，组间均数比较采用t检验或单因素方差分析，P <0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 TGF-?1和 UPP阻断剂MG-132对细胞中Smurf2mRNA表达的影响
TGF-?1作用于HK2细胞后可诱导Smurf2mRNA表达迅速上调，10min为对照组的1.21倍，1h时为对照组的3.96倍(P<0.01)，24h有所恢复但仍为对照组的1.58倍(P<0.05)。以1h为时间点观察4组中Smurf2mRNA水平表达，对照组中有基础量的Smurf2mRNA 分泌，TGF-?1+MG-132组中Smurf2mRNA表达与对照组及MG-132组差异无统计学意义，与TGF-?1组相比，Smurf2mRNA水平明显下调(P<0.01)。
2.2 TGF-?1 和UPP阻断剂MG-132对细胞中Smurf2蛋白表达的影响
TGF-?1作用于细胞后可诱导Smurf2蛋白表达迅速上调，1h为对照组的1.96倍(P<0.05)，并呈时间依赖性，24h有所恢复但仍为对照组的0.73倍(P<0.05)。以1 h作为时间点观察4组中Smurf2蛋白水平表达 ......
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