Smurf2在小管上皮细胞转分化中的表达及MG—132对其的影响(3)
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2.5 TGF-?1及泛素系统阻断剂MG-132对细胞中Smad2/3磷酸化水平影响
TGF-?1(5ng/ml)作用于HK2细胞后迅速诱发Smad2/3磷酸化，10min表达上调80倍(与0min比较，P <0.01)，1h为对照组的150倍(P <0.01)，12h为对照组近170倍，随后逐渐下降，24h时仍高于0 min时(P <0.01)。 以10min作为时间点，观察4组P-Smad2/3蛋白表达。结果显示：对照组及MG-132组无Smad2/3磷酸化表达，TGF-?1组Smad2/3磷酸化表达上调80倍(与对照组比较，P <0.01),TGF-?1+MG-132组，Smad2/3磷酸化表达较TGF-?1组下降80%( P <0.01),但Smad2/3磷酸化并未被完全阻断。
2.6免疫荧光(×200)检测间充质细胞标记物的表达
对照组及MG-132组中，免疫荧光检测可见细胞E-cadherin和cytokeratin表达；无α-SMA表达；TGF-?1刺激24h后，可见细胞E-cadherin和cytokeratin表达减少；细胞重新合成α-SMA；TGF-?1+MG-132组可见E-cadherin和cytokeratin表达增加，同时基本未见重新表达的α-SMA
3 讨论
Smads 蛋白是TGF-β1/-Smads信号途径中关键的细胞信号内介质，在该信号传导过程中，活化的R-Smads(Smad2/3)和抑制因子如Smad核转录共抑因子SnoN的表达被精密调节并保持平衡，确保TGF-β信号输出的稳定性，从而维持正常的生理功能[1-2]。除了基因转录水平的调节外，Smads 信号蛋白的表达可被泛素蛋白酶体途径(UPP)降解。UPP主要由四部分组成：泛素、泛素连接酶、26S蛋白酶体系统和泛素再循环酶。Smurf2是由748个氨基酸组成的多肽，属于泛素连接酶HECT结构域E3S家族的成员之一[2,4-5,8]。它是由Lin等[9]通过酵母双杂交技术分离鉴定出的具有与Smad2相互作用的泛素化调节因子。因其特异性识别靶蛋白底物、催化其泛素化，因而在UPP介导的蛋白降解中起到了决定性的作用。
本研究中我们观察到,TGF-?1作用于肾小管上皮细胞后Smurf2mRNA和蛋白的表达均迅速上调,与此同时SnoNmRNA表达亦相应上调。但有趣的是，Smurf2表达上调的同时也伴有SnoN蛋白表达的显著下调。在应用UPP阻断剂MG-132阻断UPP系统后，Smurf2mRNA和蛋白水平明显下调，其表达水平接近对照组表达水平；与此同时SnoN蛋白表达却明显上调接近对照组表达水平，而MG-132对SnoNmRNA的表达无明显影响。Fukasawa[6]等的研究证实：在梗阻性肾病中，Smurf2表达增加，并与SnoN形成复合物，导致SnoN蛋白的泛素化和降解显著增加，并且Smurf2的免疫耗竭可导致SnoN泛素化的减少。因此我们推测，本研究中TGF-?1诱导人近端小管上皮细胞SnoN蛋白的下调主要是由于Smurf2介导SnoN蛋白遭遇UPP降解增加所致，而不是由于基因转录水平的减弱。实验中同时观察到随着Smurf2表达增高，细胞E-cadherin和cytokeratin表达减少，同时重新表达α-SMA，而且Smurf2出现表达增高的时间明显早于α-SMA的表达。在应用MG-132阻断UPP系统，Smurf2表达降低的同时,免疫荧光检测的结果提示TGF-?1介导的α-SMA的表达亦被拮抗，同时E-cadherin和cytokeratin表达增加，这说明Smurf2在TGF-?1导致小管上皮细胞转分化过程中起重要作用，而且Smurf2表达增高很可能是TGF-?1/Smads通路活化的必要条件。
此外研究中我们还发现,TGF-?1可迅速诱导HK2细胞内Smad2/3磷酸化，酵母双杂交实验证明Smurf2可与活化的Smad2/3结合，并能优先与核内磷酸化Smad2/3结合促使其发生泛素依赖性降解[9]。但本研究中我们观察到TGF-?1诱导人近端小管上皮细胞 Smad2/3磷酸化的表达增高与Smurf2表达增高是一致的。而且研究中我们还观察到应用UPP阻断剂MG-132阻断了Smurf2表达增高，抑制小管上皮细胞转分化发生时，并不能完全阻断Smad2/3的磷酸化，Tan等[7]观察到在纤维性肾病模型中Smurf2与Smad3类似表达，但是通过转染使过度表达Smurf2可使Smad2/3的泛素化增加进而Smad2/3表达降低，可能的解释是TGF-β1致小管上皮细胞转分化过程中Smad核转录共抑因子SnoN的丢失比Smad2/3的丢失更重要，Smurf2可能是在细胞水平通过下调SnoN蛋白的表达从而对TGF-β1/Smad信号转导起重要影响。因此提示我们尽管Smurf2可同时介导TGF-β1/Smads信号中阳性调节因子SnoN和阴性调节因子Smad2/3的表达，但在TGF-β1介导小管上皮细胞转分化过程中，Smurf2功能的失调并且最终作用是增强TGF-β1/Smad信号活性 ......
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