耐多药大肠埃希菌质粒介导的耐药基因检测(1)
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【摘要】目的 了解泸州本地质粒介导的耐多药大肠埃希菌的TEM,SHV,CTX-M,CTX-M-3,CTX M-22、CTX M 24基因分布情况。方法 用K-B法进行耐药菌株的筛选。PCR扩增耐药基因。琼脂糖凝胶电泳检测基因大小。基因测序仪检测碱基序列。结果 71株大肠埃希菌中,有一株死亡。全敏6株，占8.57%,单耐16株，占22.86%,双耐18株，占26.71%,耐多药30株，占42.86%。耐多药质粒中携带：TEM有11株 , 占36.67%;SHV仅一株，所占比例较低, 占3.33%;CTX M 有23株,占76.67%; CTX M 3有21株，占70%,两种基因均含有的有12株，占40%;CTX M-22有 9株, 占12.86%；CTX M 24有 24株，占34.29%，两种基因均含有的有6株,占20%；有6株含有CTX-M-24,CTX-M两种基因。结论 泸州地区耐多药大肠埃希菌存在质粒介导的TEM、SHV、CTX-M、CTX-M-3、CTX M-22、CTX M 24基因。有3种菌株无上述六种耐药性质粒，其余的每一种菌株含有2种或者2种以上的耐药性质粒，最多的菌株含有5种耐药性质粒。耐多药的大肠埃希菌对第三代头孢菌素的头孢唑肟敏感，对头孢他啶，头孢哌酮，头孢曲松，丁胺卡那霉素中度敏感。对亚胺培南，美罗培南敏感。
【关键词】大肠埃希菌 耐多药 质粒介导TEM SHV CTX-M CTX-M-3 CTX M-22 CTX M 24
大肠埃希菌是感染性疾病中最常见的G-菌，也是医院内感染常见菌，其耐药性普遍存在，有对一种或者两种甚至多种抗生素耐药[1]，在染色体和质粒介导的耐药机制中，以质粒介导的耐药机制在耐多药传播中更具重要性。本文讨论TEM,SHV,CTX-M,CTX-M-3，CTX M-22、CTX M 24六种质粒介导的耐多药基因在本地区的分布情况,给临床选用抗生素提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 泸州医学院于2007年至2008年收集的71株临床送检标本，来源于大便，尿液，痰液，血液，腹水，分泌物等，无重复分离株，发现其中一株死亡。质控标准菌株ATCC25922系杭州天河微生物试剂公司生产。
1.1.2 抗菌药物纸片 包括左氧氟沙星(LVF)，诺氟沙星(NOR)，环丙沙星(CIP)，加替沙星(GAT)，阿莫西林(AMX)，氨苄西林(AMP)，哌拉西啉/他唑巴坦(PFP/TAZ),头孢唑啉(CFZ)，头孢他啶(CAZ)，头孢唑肟(CFX),头孢曲松(CFT)，头孢哌酮(CPZ)，头孢噻肟(CTX)，头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA), 头孢西丁(FOX)，头孢噻吩(CEF)，氨曲南 (ATM)，庆大霉素(GM)，妥布霉素(TM)，链霉素(S)，丁胺卡那霉素(AMK),亚胺培南(IPM)，美罗培南(MPM)，均系杭州天河微生物试剂公司生产。
1.1.3 试验试剂 LB粉，Augar粉，胰蛋白胨大豆肉汤粉，酪蛋白琼脂，酪蛋白粉，CTX M、CTX M 3，CTX-M-22,CTX-M-24,SHV,TEM六种基因的PCR引物，质粒小提试剂盒，2×Taq PCR Master Mix，溴化乙锭，5倍的TBE，2000pb的Marker，均由上海生物工程有限公司生产。限制性核酸内切酶EcoRI，系美国Fermentas生物工程公司生产。BLOWEST AGAROSE 系 Gene Tech(ShangHang)Company生产。大肠标准菌株ATCC25922，0.5硫酸钡比浊试剂系杭州天河微生物试剂公司生产。
1.1.4 实验仪器 天津上海跃进医用光学器械厂GNP-9082隔水式电热恒温培养箱，哈尔滨东名医疗仪器厂HZQ-C恒温空气摇床，上海安亭科学仪器厂TGL-16C型离心机，上海科析试验仪器厂XMTD型KXS恒温水浴箱，英国Hybaid公司Omn-E PCR扩增仪，北京六一仪器厂DYY-8C型水平电泳仪，上海顾村电光仪器厂ZF-90多功能暗箱式紫外投射仪，美国基因公司DNA/RNA800凝胶DNA成像仪，美国NanoDrop公司ND-1000蛋白核酸定量仪等。
1.2 方法
1.2.1 用制作的胰蛋白胨大豆肉汤，M-H液体培养基，LB液体培养基，37℃振荡培养细菌16小时，M-H固体培养基，LB粉与琼脂制作的LB琼脂平板培养24小时，细菌药敏试验K-B纸片法筛选出耐多药的大肠埃希菌。各种培养基制作标准和药敏试验判断标准按2006 纪绍梅编著《微生物培养基质控与图解》[2]。不同的抗生素有不同的标准,分为耐药(R)，中度敏感(M)，敏感(S)。菌液稀释以0.5麦氏单位硫酸钡比浊管浓度为标准。在直径9cm的平皿培养基上每个共放7个药敏纸片 ......
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