T-SPOT.TB在结核病诊断中的临床意义(2)
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1.资料和方法
1.1 研究对象一组为随机选取2013年1月-12月间在我院住院的肺结核病人30例，结核性胸膜炎30例，结核性脑膜炎9例，先进行T-SPOT.TB检测和血清、胸腔积液及脑脊液的ADA检测；第二组为某医院在职并进行健康查体职工，包括各临床科室的医生、护士，各医技科室工作人员，行政及后勤科室的工作人员，男100人，女191人，共291人。
1.2 方法
1.2.1样本采集69例在院病人，由医生先与病人沟通，在病人同意后由护士在病人做其他血液检验时多抽一管肝素锂抗凝血5ml，颠倒混匀，备用。结核性胸膜炎30例，在为病人抽取胸腔积液进行检验时多留一管进行ADA检测，结核性脑膜炎9例，在为病人抽取脑脊液进行检验时多留一管进行ADA检测;在某医院工作人员查体时，采集生化血液之后，采集静脉血5ml于含有肝素锂抗凝剂的试管中，立即颠倒混匀5-8次，备用。
1.2.2酶联免疫斑点试验按照T-SPOT.TB(英国Oxford Immunotec Ltd生产，上海信长有限公司代理)试剂盒的说明书进行操作，采用密度梯度法离心提取单个核细胞(PBMC)，并计数单个核细胞浓度，用细胞培养液调节细胞浓度至2.5*109/L，在已包被抗IFN.7抗体微量板的4个孔中，分别加入细胞培养液作为阴性对照，植物血球凝集素(PHA)作为阳性对照,结核杆菌特异混合多肽A和B分别含EsAT.6和CFP.10(Oxford Immunotec Ltd,Oxford UK)。然后在每个孔中加入100?l上述细胞悬液，轻轻混匀。把微量板放在37℃培养16-20小时后，用PBS洗板4次，加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN.7单克隆抗体，轻轻混匀，在2-8℃下孵育1小时。取出用PBS洗涤4次。最后每孔加入显色底物液BCIP/NBTPLUS,室温静置7分钟后观察结果，并在放大镜(或显微镜)下进行斑点计数。
1.2.3结果判断根据试剂盒使用说明判断结果：如果阴性对照孔SFC为0-5，则测试孔SFC-阴性对照孔SFC≥6视为阳性，如果阴性对照孔SFC≥6,则测试孔SFC≥2倍阴性对照孔SFC视为阳性 ......
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