顺铂缓释剂对人胃癌裸鼠移植瘤生长以及 CD44V6\PTEN表达的影响(2)
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参见附件。
1.2.2 免疫组化法及其结果判定
1.2.2.1 SP 免疫组化法检测PTEN、CD44V6蛋白表达石蜡切片脱蜡水化后，每隔3 min用 pH 为7. 4的PBS冲洗1次(共三次); 对组织抗原进行相应的修复;13% H2O2( 50μl/张)室温孵育10 min。PBS冲洗3次，间隔3 min; 弃PBS液，每张切片滴加50μl对应的一抗 ，室温孵育60 min，PBS 冲洗3 次，间隔3 min; 弃 PBS 液，滴1滴即用型 MaxvisionTM快捷免疫组化试剂，室温孵育10 min，PBS 冲洗 3 次，间隔3 min; 除去PBS，滴100μl DAB ，冲洗，苏木精复染，PBS 冲洗反蓝，脱水干燥，二甲苯透明，晾干封片待干燥后镜检计数。
1.2.2.2 免疫组化结果判定 PTEN 蛋白染色以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，CD44V6 蛋白染色以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。400×镜下从每张组织切片染色的最强区域中选10个视野，使用目镜网格微尺计数 1 000 个细胞计算阳性细胞率。(阳性细胞率 = 阳性细胞数/肿瘤细胞数 ×100%)
1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡
取出四组新鲜的肿瘤组织进行适度研磨，用PBS冲洗经筛网过滤后制成细胞混悬液，离心(2000r/min,5min)，弃上清，用200μLPBS混悬，离心(2000r/min,5min)，弃上清后用100μL1x buffer 混悬至1x106分别装于四个1.5 mL的EP管内，加5μL Annexin V，室温避光放置30min ，经1x的buffer洗涤后用200μL 1x的buffer制成细胞混悬液 ......
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