荧光定量PCR在血流感染病原体检测中的临床应用
摘要：目的：探讨荧光定量PCR在血流感染病原体检测中的临床应用。方法：设计出mecA基因的引物，使用荧光定量PCR法检测分离的64株金黄色葡萄球菌引起血流感染标本，并与头孢西丁纸片扩散法进行比较。结果：64株金黄色葡萄球菌中，荧光定量PCR法检测出mecA基因阳性40例，阴性28例；头孢西丁纸片扩散法检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌25株，甲氧西林金黄色葡萄球菌39株，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光定量PCR法的检测率显著高于头孢西丁纸片扩散法(P<0.05)。结论：荧光定量PCR检测方法具有高敏感性高特异性以及快捷简便的特点，为检测血流感染病原体提供了有效快速的检测手段。
关键词：血流感染；革兰染色特异探针荧光实时定量PCR；基因芯片
资助基金：湖南省教育厅青年项目(14B185)
血流感染(Bloodstream infections，BSI)常导致严重后果，虽然在微生物诊断与抗微生物治疗方面已取得很多进展，败血症(sepsis)依然在住院患者感染中占有重要比例而在院内死亡原因中位列第三[1]。快速检测、鉴定和药敏谱分析对于成功救治血流感染患者至关重要[2]。本文探讨荧光定量PCR在血流感染病原体检测中的临床应用。现报道如下。
, 百拇医药
1. 资料与方法
1.1 一般资料 选取经临床分离的64株金黄色葡萄球菌引起血流感染标本进行研究。
1.3.1 提取细菌的DNA 全自动血培养仪取100μl血液，依照细菌基因组DNA小量纯化试剂盒的说明提取细菌的DNA ，于-20℃下保存。
1.2仪器与试剂 上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒、mecA基因扩增引物、PCR扩增通用试剂盒、探针；美国ABI公司的PE5700荧光PCR扩增仪；法国生物梅里埃公司的VITEK-32全自动细菌鉴定仪；BD9050型全自动血培养仪；英国Oxoid公司的30μg头孢西丁纸片；M-H琼脂；细菌基因组DNA小量纯化试剂盒、Takara宝生物(大连)有限公司的Bacteria Screening PCR kit 试剂盒。
1.3 方法 荧光探针CCCTCAAACAGGTGAATT，正向引物：5，—CCCTCAAACAGGTGAATT—3，；反向引物：5，—ATGAAGGTGTGCTTACATGAAGGTGTGCTTACAAGTGCTAA—3，以TAMRA为淬灭基团。
, 百拇医药
1.4 mecA基因反应体系 0.5μlDNA模板， 0.5μl探针， 0.5μl上游和下游引物，包括DNA聚合酶、dNTP、MgCl2 、PCR缓冲液的12.5μl PCR mix，y用重蒸灭菌水补足至25μl。在95℃下预变性1分钟，之后95℃下30秒，59℃下30秒，72℃下30秒进行30个循环，最后在72℃下进行1分钟。
1.5 结果判定标准 (1)实时荧光PCR法：依据是否具有荧光特异性曲线判断是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。(2)头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：抑菌环直径≤21mm即为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，≥22mm即为即为甲氧西林金黄色葡萄球菌。
1.6 统计学处理 采用SPSS17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计数资料之间的比较采用卡方检验进行分析，统计结果以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
, 百拇医药
64株金黄色葡萄球菌中，荧光定量PCR法检测出mecA基因阳性40例，阴性28例；头孢西丁纸片扩散法检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌25株，甲氧西林金黄色葡萄球菌39株，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光定量PCR法的检测率显著高于头孢西丁纸片扩散法(P<0.05)。
3. 讨论
PCR 是最常用的基因扩增方法，在BSI 快速诊断中应用前景广泛[3]。是体外在聚合酶的作用下扩增DNA片段的技术，工作原理是以似扩增的DNA片段为模板，以与模板互补的寡核苷酸链为引物，在聚合酶的作用下，沿着模板链依据半保留式复制的原理合成新的DNA，包括模板DNA的变性、模板DNA与引物的复性、引物的延伸等三个步骤，这三个步骤反复进行，使DNA的数量呈指数上升[4]。当在PCR反应中加入荧光基团，通过荧光信号的强度对PCR反应过程进行监测，通过标准曲线法定量分析未知模板，即为实时荧光定量PCR[5]。荧光定量PCR按照化学原理分为探针法和非探针法。探针法使用与靶序列特异性结合的探针来监测扩增产物的增加， 如分子信标、水解探针、杂交探针等。
, http://www.100md.com
本研究表明，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光定量PCR法的检测率显著高于头孢西丁纸片扩散法(P<0.05)，荧光定量PCR法具有操作简便、提取简单、可在短时间内检测，依据荧光的扩增曲线和对数增加可直接判断结果。综上所述，荧光定量PCR检测方法具有高敏感性高特异性以及快捷简便的特点，为检测血流感染病原体提供了有效快速的检测手段。分子生物学的方法日新月异，国内实验室一般都具备进行分子生物学诊断的仪器与人员条件，关键在于如何巧妙地将各类技术结合在一起，能够达到快速、准确、价廉、可操作性强，从而建立具有自主知识产权的、更为优化的BSI 病原微生物快速检测技术平台。
参考文献：
1. Gaibani， P.， et al.， Blood culture systems： rapid detection--how and why Int J Antimicrob Agents， 2009. 34 Suppl 4： p. S13-5.
, 百拇医药
2. Fenollar， F. and D. Raoult， Molecular diagnosis of bloodstream infections caused by non-cultivable bacteria. Int J Antimicrob Agents， 2007. 30 Suppl 1： p. S7-15.
3. Dierkes， C.， et al.， Clinical impact of a commercially available multiplex PCR system for rapid detection of pathogens in patients with presumed sepsis. BMC Infect Dis， 2009. 9： p. 126.
4. 康素明，潘忠诚，张玉魁，何群，马佳明，赵雨杰， 临床常见致病菌快速诊断用芯片的初步构建. 中国医科大学学报， 2005. 34(4)： p. 299-301.
5. 张卓然， 高鹏， 李琳，周世航，詹銮峰， 微生物非培养鉴定技术在临床标本检查中的应用研究. 微生物学杂志， 2009. 29(3)： p. 18-24., 百拇医药(李杰 严洁 蒋恒波)
关键词：血流感染；革兰染色特异探针荧光实时定量PCR；基因芯片
资助基金：湖南省教育厅青年项目(14B185)
血流感染(Bloodstream infections，BSI)常导致严重后果，虽然在微生物诊断与抗微生物治疗方面已取得很多进展，败血症(sepsis)依然在住院患者感染中占有重要比例而在院内死亡原因中位列第三[1]。快速检测、鉴定和药敏谱分析对于成功救治血流感染患者至关重要[2]。本文探讨荧光定量PCR在血流感染病原体检测中的临床应用。现报道如下。
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1. 资料与方法
1.1 一般资料 选取经临床分离的64株金黄色葡萄球菌引起血流感染标本进行研究。
1.3.1 提取细菌的DNA 全自动血培养仪取100μl血液，依照细菌基因组DNA小量纯化试剂盒的说明提取细菌的DNA ，于-20℃下保存。
1.2仪器与试剂 上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒、mecA基因扩增引物、PCR扩增通用试剂盒、探针；美国ABI公司的PE5700荧光PCR扩增仪；法国生物梅里埃公司的VITEK-32全自动细菌鉴定仪；BD9050型全自动血培养仪；英国Oxoid公司的30μg头孢西丁纸片；M-H琼脂；细菌基因组DNA小量纯化试剂盒、Takara宝生物(大连)有限公司的Bacteria Screening PCR kit 试剂盒。
1.3 方法 荧光探针CCCTCAAACAGGTGAATT，正向引物：5，—CCCTCAAACAGGTGAATT—3，；反向引物：5，—ATGAAGGTGTGCTTACATGAAGGTGTGCTTACAAGTGCTAA—3，以TAMRA为淬灭基团。
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1.4 mecA基因反应体系 0.5μlDNA模板， 0.5μl探针， 0.5μl上游和下游引物，包括DNA聚合酶、dNTP、MgCl2 、PCR缓冲液的12.5μl PCR mix，y用重蒸灭菌水补足至25μl。在95℃下预变性1分钟，之后95℃下30秒，59℃下30秒，72℃下30秒进行30个循环，最后在72℃下进行1分钟。
1.5 结果判定标准 (1)实时荧光PCR法：依据是否具有荧光特异性曲线判断是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。(2)头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：抑菌环直径≤21mm即为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，≥22mm即为即为甲氧西林金黄色葡萄球菌。
1.6 统计学处理 采用SPSS17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计数资料之间的比较采用卡方检验进行分析，统计结果以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
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64株金黄色葡萄球菌中，荧光定量PCR法检测出mecA基因阳性40例，阴性28例；头孢西丁纸片扩散法检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌25株，甲氧西林金黄色葡萄球菌39株，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光定量PCR法的检测率显著高于头孢西丁纸片扩散法(P<0.05)。
3. 讨论
PCR 是最常用的基因扩增方法，在BSI 快速诊断中应用前景广泛[3]。是体外在聚合酶的作用下扩增DNA片段的技术，工作原理是以似扩增的DNA片段为模板，以与模板互补的寡核苷酸链为引物，在聚合酶的作用下，沿着模板链依据半保留式复制的原理合成新的DNA，包括模板DNA的变性、模板DNA与引物的复性、引物的延伸等三个步骤，这三个步骤反复进行，使DNA的数量呈指数上升[4]。当在PCR反应中加入荧光基团，通过荧光信号的强度对PCR反应过程进行监测，通过标准曲线法定量分析未知模板，即为实时荧光定量PCR[5]。荧光定量PCR按照化学原理分为探针法和非探针法。探针法使用与靶序列特异性结合的探针来监测扩增产物的增加， 如分子信标、水解探针、杂交探针等。
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本研究表明，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光定量PCR法的检测率显著高于头孢西丁纸片扩散法(P<0.05)，荧光定量PCR法具有操作简便、提取简单、可在短时间内检测，依据荧光的扩增曲线和对数增加可直接判断结果。综上所述，荧光定量PCR检测方法具有高敏感性高特异性以及快捷简便的特点，为检测血流感染病原体提供了有效快速的检测手段。分子生物学的方法日新月异，国内实验室一般都具备进行分子生物学诊断的仪器与人员条件，关键在于如何巧妙地将各类技术结合在一起，能够达到快速、准确、价廉、可操作性强，从而建立具有自主知识产权的、更为优化的BSI 病原微生物快速检测技术平台。
参考文献：
1. Gaibani， P.， et al.， Blood culture systems： rapid detection--how and why Int J Antimicrob Agents， 2009. 34 Suppl 4： p. S13-5.
, 百拇医药
2. Fenollar， F. and D. Raoult， Molecular diagnosis of bloodstream infections caused by non-cultivable bacteria. Int J Antimicrob Agents， 2007. 30 Suppl 1： p. S7-15.
3. Dierkes， C.， et al.， Clinical impact of a commercially available multiplex PCR system for rapid detection of pathogens in patients with presumed sepsis. BMC Infect Dis， 2009. 9： p. 126.
4. 康素明，潘忠诚，张玉魁，何群，马佳明，赵雨杰， 临床常见致病菌快速诊断用芯片的初步构建. 中国医科大学学报， 2005. 34(4)： p. 299-301.
5. 张卓然， 高鹏， 李琳，周世航，詹銮峰， 微生物非培养鉴定技术在临床标本检查中的应用研究. 微生物学杂志， 2009. 29(3)： p. 18-24., 百拇医药(李杰 严洁 蒋恒波)