肝纤维化与单个核细胞及转化生长因子的关系研究
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【摘要】 文中探讨了肝纤维化的发生与慢性肝病患者单个核细胞(PBMC)及血浆中转化生长因子β1(TGF-β1)的关系。采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法检测慢性肝病患者PBMC中TGF-β1mRNA含量，采用ELISA方法检测血浆中TGF-β1含量，采用放射免疫方法检测HA，LN，CIV，PCⅢ含量。同时对检测结果进行了对比分析，以探讨各检测指标的相关性。结果表明：慢性乙型肝炎中重度患者及患有肝炎的肝纤维化患者PBMC中TGF-β1含量及血浆TGF-β1水平均显著高于正常水平，且与HA，LN，CIV，PCⅢ四项肝纤维化诊断指标呈正相关。因此，慢性肝病患者PBMC及血浆中TGF-β1含量水平可以作为肝纤维化的诊断指标，但能否作为早期诊断的敏感指标，仍需要临床大量试验证实。
【关键词】肝纤维化 PBMC TGF-β1 慢性肝病患者
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【中图分类号】R657.3+1
【文献标识码】A
【文章编号】1814-8824(2008)-12-0010-02
肝纤维化是各种致病因子持续作用于肝脏，导致慢性肝损伤后的共同病理改变，各种细胞因子参与肝纤维化的发生。诱发肝纤维化的机制包括：诱导肝星状细胞(HSC)转化为肌成纤维细胞、增加细胞外基质的合成、抑制细胞外基质的降解、抑制肝细胞再生、诱导肝细胞凋亡。
目前对肝纤维化的诊断指标的金标准为肝组织活检，这在临床上无法作为常规项目广泛开展。临床上常采用透明脂酸(HA)，层粘连蛋白(LN)，Ⅳ型胶原(CIV)，Ⅲ型前胶原(PCⅢ)联合诊断来判断肝炎肝纤维化病情的发展阶段。郑敏等[1]应用ROC曲线分析联合检测上述4项指标发现，该方法可提高肝纤维化诊断的特异性，但灵敏度不高。因此仍需要寻找诊断肝纤维化敏感的指标。
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近年来，Bdossa P.等研究人员发现，转化生长因子β1(TGF-β1)在肝纤维化的发生中起关键作用[2]。为此，我们检测了慢性肝病患者单个核细胞(PBMC)中TGF-β1mRNA以及血浆中TGF-β1含量，并探讨其在肝纤维化中的诊断意义，以及与HA，LN，CIV，PCⅢ四项肝纤维化诊断指标的相关性。
1 研究对象与检测方法
1.1 研究对象
1.1.1 患者 60例慢性肝病连续住院患者，男43例，女17例，平均年龄44(23~75岁)。其中慢性乙型肝炎轻度15例，中度12例，重度11例，肝炎后肝硬化22例。诊断按2000年9月中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学分会联合修订的标准进行临床分型[3]，所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒合并感染。正常对照组30名，男15名，女15名，平均年龄23(18~22)岁。
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1.1.2 主要试剂与仪器 ExTaq R-PCR试剂盒，BcaBEST RNA PCR kit Verl.1，T7RNA聚合酶，DNaseI(RNase Free)购于TaKaRa公司；PUcm-T载体，限制性核酸内切酶EcoRI，HindⅢ，Trizol购于Sangon公司；HA，LN，CIV，PCⅢ放射免疫检测试剂盒购于北京北方生物技术研究所；人血浆TGF-β1检测试剂盒购于上海晶美生物工程公司；opticon2荧光定量PCR仪(美国MJ公司)。
1.2 检测方法
1.2.1 荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测PBMC中TGF-β1mRNA
1.2.1.1 PBMC中总RNA的提取 无菌取静脉血1ml，EDTA.Na2抗凝，使用Ficoll分离液分离PBMC；取5μl细胞溶液充池在显微镜下计数细胞，用Trizol提取细胞总RNA，-70℃保存备用。
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1.2.1.2 TGF-β1mRNA水平检测 ①引物与探针：按照Genbank收录的TGF-β1mRNA全序列[NM-000660]，用Primer premier 5.0软件设计引物。上游引物为5′-CGCGTGCTAATGGTGGAAA-3′下游引物为：5′-CGCTTCTCGGAGCTCTGATG-3′，扩增片段长102bp。根据产物序列设计荧光标记探针：5′-FAM-CCACAACGAAATCTAT-MGB-3′。引物和探针由上海基康生物工程有限公司合成。②构建靶基因TGF-β1的重组质粒，按分子生物学常规方法操作。③体外转录合成cRNA标准品：用HindⅢ单酶切重组质粒使质粒完全线性化。取0.5μg线性化的质粒进行体外转录，体系为2μl缓冲液，2μl DTT，4μl NTP(ATP，GTP，CTP，UTP各2.5mmol/L)，RNase抑制剂20U，T7RNA聚合酶40U，RNase Free dH2O至20μl，在37℃保温1h，使用无RNase的DNaseI消化质粒，酚/氯仿去蛋白，乙醇沉淀cRNA，cRNA沉淀溶解于200μl RNase Free dH2O中。④荧光定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA
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(1)RT反应：取1μl总RNA以随机9聚体引物进行逆转录，获得cDNA;(2)PCR检测：25μl反应体系含上述cDNA 2μl，ExTaq R-PCR酶0.05U，Mg2+ 4mmol/L，dNTP 0.3mmol/L，TaqMan-MGB 探针400nmol/L，正反向引物各200nmol/L，循环参数为95℃15S热启动；94℃15S，60℃30S，40个循环；同时设RT质控和PCR扩增两个空白对照。(3) 扣除空白管的荧光强度，调解基线至适宜处，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即Ct值，根据标准浓度对数值与Ct值相对关系制作标准曲线，求出各待测标本TGF-β1的初始拷贝。
1.2 .2 血浆TGF-β1检测采用双抗体夹心ELISA方法，按试剂盒说明书进行。
1.2.3 HA，LN，CIV，PCⅢ检测按试剂盒说明书进行。
2 结果分析
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2.1 TGF-β1的水平与肝纤维化的关系 各型慢性肝病患者PBMC中TGF-β1mRNA水平及血浆TGF-β1含量详见表1。
2.2 TGF-β1的水平与HA、LN、CIV、PCⅢ四项指标的相关性 所有受试患者按血清HA、LN、CIV、PCⅢ四项指标测定值正常与否，分为4组。第1组为一项指标增高者；第2组为两项指标增高者；第3组为三项指标增高者；第4组为四项指标增高者。比较4组患者及正常组之间PBMC中TGF-β1mRNA及血浆TGF-β1的差异，结果详见表2。
3 结论
本研究显示肝纤维化在慢性肝病中度即已出现，并随着病情加重，肝脏纤维化程度日趋严重。肝纤维化较肯定的患者，TGF-β1 mRNA水平较高；而TGF-β1 mRNA增高幅度较低的患者，肝纤维化活动程度亦较低。同时有研究表明，在体内抑制TGF-β1的活化和信号传导，能够预防肝脏损害和肝纤维化的发生[5]。
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经上述分析和研究表明：慢性肝病患者PBMC和血浆中TGF-β1水平可以作为肝纤维化的诊断指标。但PBMC中TGF-β1 mRNA 含量及血浆中TGF-β1水平测定能否作为肝纤维化早期诊断的敏感指标，还有待于今后进一步研究证实。
参考文献
1 郑敏，蔡卫民，翁红雷,等.ROC曲线评价血清纤维化指标对诊断肝纤维化的价值[J].中华传染病杂志，2002，20：225-228.
2 Bdossa P，Paradis V.Transforming growth facter beta (TGF-beta)：a key-role in liver fibrogenesis[J].J Hepatol，1995，22：37-42.
3 中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病学会会.病毒性肝炎防治方案[J].中华传染病杂志，2001，19：56-62.
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4 Caelers A，Berishvili G，Meli ML，et al.Establishment of a real-time RT-PCR for the determination of absolute amounts of IGF-I and IGF-Ⅱ gena expression in liver and extrahepatic sites of the tilapia[J].Gen Comp Endocrinol，2004，137：196-204.
5 Kondou H，Mushiake S，Etani Y，et al.A blockingPeptide for transforming growth factor-betal activation prevents hepatic fibrosis in vivo[J].J Hepatol，2006,39：742-748., 百拇医药(徐邵华)