静脉注射secretin对大鼠脑脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸含量影响的研究
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摘要 目的：观察外周的Secretin对大鼠脑脊液中神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸含量改变来研究其对中枢神经元活动影响的机制及途径。方法：通过高效液相色谱法测量静脉注射Secretin(0.16 μg•kg-1)后不同时刻大鼠脑脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，观察谷氨酸和γ-氨基丁酸含量的改变。结果：静脉注射Secretin使大鼠脑脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸含量都增高，并且呈明显时-效关系。结论：外周的Secretin能改变大脑内神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，这可能是Secretin引起中枢神经功能改变的基本机制。
关键词 促胰液素；高效液相色谱；谷氨酸；γ-氨基丁酸
Abstract Objective：To investigate the path and mechanism of peripheral secretin to effect central neuronal activity through observing the change of GLU and GABA’s contents in rats’CSF. Method：GLU and GABA’s content in different moment in rats’CSF was measured by HPLC after i.v secretin. Result：GLU and GABA’s content in rats’CSF increased and display time-effect relationship after secretin being injected into vein of rats. Conclusion： this was possibly basic mechanism of peripheral secretin effecting function of central nerve that contents of GLU and GABA as neurotransmitter in cerebrum were changed by peripheral secretin.
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Key words Secretin；HPLC；glumatic acid；GABA
众所周知，外周十二指肠和空肠上段粘膜内S细胞分泌Secretin(促胰液素)对胃酸分泌和胃的运动都有很强的抑制作用，但是近年来有研究表明静脉注射能不仅能改善孤独症患者常罹患的胃肠道症状，还能明显提高这些患者的语言、注意力、目光接触能力[1,2]。但是这些研究都是建立在临床观察的基础上的，而对Secretin产生这些作用的机制目前并不十分清楚。还有实验显示Secretin能引起大鼠中枢多个神经核团的神经元内c-fos蛋白的表达，提示Secretin的这种作用很可能与中枢内神经元的功能改变有关[3]。本实验则通过收集静脉注射过Secretin的大鼠的脑脊液，检测其中谷氨酸和γ-氨基丁酸这两种脑内最主要神经递质的含量来研究Secretin对中枢神经元活动的影响，进一步揭示Secretin对中枢神经元的影响的机制。
1 材料与方法
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1.1实验试剂及仪器
Secretin由美国罗彻斯特大学医学中心消化和肝病中心馈赠，Secretin用0.2%小牛血清白蛋白配置成1μg•ml-1标准液，备用。Angilent 1100系列高效液相色谱仪(美国Angilent公司)，Angilent
1100 UV检测器及色谱数据处理系统(美国Angilent公司)，Hypersil C18柱(4.6×150mm，5µm)(大连依利特公司)，TGL-16高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)。
1.2实验动物及分组
健康成年Wistar大鼠20只(由重庆医科大学动物实验中心提供)，体重250～300g，雌雄不拘。实验前禁食24h，自由饮水。将20只大鼠随机分为2组(每组10只)，① BSA对照组：静脉注射0.2%BSA 0.3ml；② secretin组：注射剂量0.16 μg•kg-1，用0.2%BSA稀释为0.3ml，用自动抽注机从静脉均匀注入(约3分钟)。
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1.3脑脊液标本的收集
大鼠以20%乌拉坦腹腔注射麻醉(20% Urethane， 6ml•kg-1称重)，颈部正中切开，游离气管和颈静脉，行气管插管，备人工呼吸用。一侧颈静脉插管输液，备注射药物用。动物俯卧位，颈背部皮肤剪毛，暴露皮肤，从枕骨开始沿正中线向下切约2cm 纵向切口，咬去枕骨大孔至后臼的颅骨，于靠近枕骨大孔处以注射针头挑破硬脑膜，插入脑脊液引流导管，将脑脊液收集于离心管中。每半小时收集的脑脊液作为一个检测单位。
1.4 高效液相色谱分析
取脑脊液40μL+40μL乙腈，混匀，离心5min(15000r),取上清液+40μL0.5mol/LNaCO3+20μL 2，4-二硝基氟苯，混匀，暗中衍生1h(水浴60℃)，进样30μL进行高效液相色谱分析。
2 统计方法
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采用SAS统计软件作处理。实验数据用均数±标准差(x±s)表示，实验组内进行配对t检验，组间采用单因素方差分析,以P<0.05为有显著性差异。
3 实验结果
3.1 静脉注射Secretin对脑脊液中的谷氨酸的含量的影响
静脉注射Secretin后脑脊液中的谷氨酸的含量就逐步增加(P<0.05),注射后60min达最高点，并维持到90min然后缓慢下降逐渐恢复到接近对照水平。 对照组静脉给予0.2%的BSA 0.3ml，观察3小时，脑脊液中的Glu含量基本保持稳定，无较大的波动(P>0.05)。如表1。
3.2 静脉给予secretin对脑脊液中的GABA含量的影响
静脉注射Secretin后脑脊液中GABA的含量即增加(P<0.05)，在30min即达接近最高点并持续到90min (P<0.05)，随后其含量逐渐下降，约180min后，GABA的含量基本恢复到对照水平(P>0.05)。对照组静脉给予0.2%的BSA0.3ml，观察3小时，脑脊液中的GABA含量基本保持稳定，无较大的波动(P>0.05)。如表2。
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4 讨论
Secretin一直以来作为一种经典的胃肠道激素，已经为人们所广泛接受。现已明确Secretin是一种由27个氨基酸残基组成的具有螺旋结构的碱性多肽，在进食等外界刺激下分泌，具有调节胰腺外分泌(主要是胰液量和重碳酸氢盐)，抑制胃酸分泌和胃运动等多种生理功能[4]。但是随着研究的深入越来越多的临床证据表明secretin能够影响中枢神经核团的功能，一些学者还认为secretin 极可能是一种脑肠肽[5]但目前还缺乏直接的证据证实。本实验通过在不同时间收集静脉注射过Secretin的大鼠的脑脊液，检测其中谷氨酸和γ-氨基丁酸这两种脑内最主要神经递质的含量来研究Secretin对中枢神经元活动的影响，为Secretin的中枢作用提供一定的理论基础。
我们在本实验中发现静脉注射secretin后，大鼠脑脊液中的谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量都发生了改变，并且两者的含量在一定时间内都逐步增加，这与Kuntz A[6]等研究结果一致。这表明外周的secretin能影响中枢的神经元功能，并且这种影响作用很可能是通过改变中枢中神经递质含量如谷氨酸和γ-氨基丁酸实现的。, 百拇医药(陈 卫 李世清 沈成义)