P21/CIP1与三苯氧胺诱导MA782细胞凋亡的关系
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摘要目的：探讨Tamoxifen(TAM)诱导ER阴性小鼠乳腺癌细胞MA782凋亡的分子机制。方法：TAM诱导MA782细胞， MTT检测细胞增殖活性，FCM检测细胞凋亡和细胞周期，IHC检测p21 /CIP1(简称p21)蛋白并用病理图像分析软件进行半定量分析。结果： TAM能明显抑制MA782细胞生长并诱导其凋亡，不同浓度TAM诱导细胞不同时间后p21蛋白有不同程度的上升，与对照组相比差异显著(P<0.01)。结论：TAM诱导MA782细胞凋亡与其上调细胞p21蛋白有关。
关键词TAM；MA782细胞；凋亡；p21
众多研究表明TAM对ER阳性患者有效，对ER阴性患者收效甚微，但体外研究表明TAM对ER阴性的乳腺癌细胞亦有细胞毒性作用，但其作用机制不清。鉴于此，本试验通过培养ER阴性小鼠乳腺癌细胞MA782，用TAM处理并进行检测与观察，以此对TAM治疗乳腺癌的分子机制进行探索性研究。
, 百拇医药 1材料和方法
1.1试剂和仪器
TAM、RPMI1640培养基(Gibco公司)，小牛血清、MTT(上海生工)，p21鼠抗单克隆抗体、SABC试剂盒(武汉博士德)，酶标仪 (ELX-800, American)，流式细胞仪(FACS Star, Bector Dickinson)
1.2细胞培养
RPMI1640培养基(含10%小牛血清)常规恒温恒湿培养。
1.3MTT检测
取对数生长期细胞常规接种于96孔培养板(3×103个/孔)，24h后实验组加入不同浓度(2，6，10 ?滋mol/L)TAM 180 ?滋l，对照组加等量RPMI 1640，分别于加药后24h、48h、72h、96h加入MTT(5 mg/ml) 20 ?滋l继续培养4 h，弃去培养液，每孔加150 ?滋l DMSO，混匀10分钟，酶标仪检测吸光值。
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1.4FCM检测
取对数生长期细胞，接种于50 ml培养瓶(3×105个/瓶)，24h后实验组加入不同浓度TAM，对照组加1640，分别于加药后24h、48h常规消化，离心、固定、染色后流式细胞仪检测。
1.5IHC检测
取对数生长期细胞，接种于置有载波片的培养皿，24h后实验组加入不同浓度TAM，对照组加1640，分别于加药后48h，72 h终止培养，染色步骤按SABC，DAB试剂盒说明书操作，结果判断：胞核和/或胞质呈棕褐色为阳性，高倍视野下随机计数五个视野细胞总数，计算出阳性率, 并用病理图像分析软件进行蛋白半定量分析。
1.6统计分析
采用SPSS13.0软件，t检验分析组间差异。
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2结果
2.1MTT检测结果
2?滋mol/LTAM诱导细胞三天后出现生长抑制，而6、10 ?滋mol/L组分别在作用两天和一天后即表现出明显的细胞生长抑制(P<0.01)，并且随着作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降。
2.2FCM检测结果
2?滋mol/L组未出现凋亡峰， 6、10 ?滋mol/L组则出现凋亡峰 。凋亡率、G0/G1期、S期变化均具有统计学意义(p<0.01)(见表1)。
2.3IHC及半定量分析结果
2?滋mol/L TAM诱导细胞72h后p21蛋白灰度值从93.6显著上升到112.81(P<0.01)， 6、10?滋mol/L TAM诱导细胞48、72h后，其灰度值上升更显著(P<0.01)，两时间段相比亦有显著性差异(P<0.01)(见表2)。
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3讨论
细胞周期与肿瘤的关系是近年来生命科学研究的热点。有人认为肿瘤是一类细胞周期疾病，细胞周期紊乱是肿瘤发生、发展的重要原因。细胞周期的正常进行受到细胞周期调控系统的严密调控，该系统包括细胞周期素(cyclins)-细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclins-dependent kinases CDKS)-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin -dependent kinase inhibitor CKIS)。其核心为CDKS的活性表达与调控， cyclins对其进行正性调控，ckis进行负性调控[1]。
p21属广泛性cdks抑制因子[2]，与相应的cyclins /cdks结合，使cdks失活，对细胞周期起负性调节作用，同时p21C端第124～164氨基酸能与PCNA结合，覆盖PCNA上的某些功能区，阻碍PCNA与DNA聚合酶δ形成复合物，使DNA全酶复合物不能在DNA单链上滑动，影响DNA复制。在体外培养的ER阳性MCF-7乳腺癌细胞中发现雌激素可抑制p21和p27[3,4]，激活G1期cdk，促进细胞周期进程，抗雌激素药物如TAM可引起细胞周期阻滞，上调p21和p27水平，增加其与cyclin E/cdk结合力，引起cdks抑制。该研究表明p21在乳腺癌的抗雌激素治疗中起着重要的作用。我们的实验结果与此相符，ER阴性MA782经不同浓度TAM诱导不同时间后p21蛋白有不同程度的上升，与对照组相比差异显著。说明对ER阴性的乳腺癌细胞，TAM也可通过上调p21来抑制细胞的增殖。
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从上述研究结果可以看到，较高浓度(大于2 ?滋mol/L)的TAM对ER阴性乳腺癌细胞也有生长抑制和诱导凋亡作用，并呈时间、剂量依赖性。TAM诱导ER阴性乳腺癌细胞凋亡与其上调细胞周期负性调节因子 p21蛋白有直接关系，由此启发我们控制细胞周期紊乱是ER阴性乳腺癌治疗的新方向。
参考文献
[1]Koroxenidou L、Ohlson LC, PorschHallstrom I. Long-term 17alpha-ethinyl estradiol treatment decreases cyclin E and cdk2 expression,reduces cdk2 kinase activity and inhibits S phase entry in regenera-ting rat liver [J]. JHepato,l 2005, 43(3): 478-484.
, 百拇医药 [2]赵俊杰、朱岷、黄铁生等. p21WAF1基因遗传多态性与乳腺癌发病关系的风险[J].江苏医药,2007, 33( 11):1110-1112.
[3]Li G、 Liu Z、Sturgis EM, et al. Genetic polymorphisms of p21are associated with risk of squamous cell carcinoma of the headand neck[J].Carcinogenesis,2005,26(9):1596-1602.
[4]王峰、王水、陆辉等.乳腺癌组织中p21WAF1、CDK4的表达及意义[J].江苏医药,2006,32(6):520-522., 百拇医药(吴建芳)