分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析
摘 要目的:分析研究分子生物学技术聚合酶链反应(PCR)对结核病检测的临床应用,并对其应用进行方法学评价。方法:采用分子生物学技术体外核酸扩增聚合酶链反应对临床疑似结核病标本进行结核分枝杆菌检测。结果:分子生物学技术聚合酶链反应对临床标本可以明确区分结核杆菌与其它分枝杆菌和一般呼吸道微生物,能从含有大量人类核酸和其它分枝杆菌的标本中检测到结核杆菌,实验快速,整个实验在一天完成,灵敏度高特异性强。结论: 分子生物学技术聚合酶链反应对结核病的临床诊断是一项敏感性高,特异性强,简便快速等特点的诊断技术,对结核病的诊断具有较高的临床意义。
关键词结核病;结核分枝杆菌;聚合酶链反应
20世纪90年代,全球多数发达国家结核病疫情出现明显回升,许多发展中国家出现结核病疫情严重加剧,结核病已成为全球最紧迫的公共卫生问题,目前世界上没有任何一个国家能逃脱结核病的威胁。每年全世界约有800万新发病人,约300万人因结核病而死亡。我国的情况也是如此,据2000年第四次全国结核病流行病抽样调查表明,我国结核病的形势仍然十分严峻。结核病流行病学显示高患病率、高耐药率、低递降率等特点 [1]。因此快速准确的诊断是控制结核病的主要条件,我们对使用分子生物学技术聚合酶链反应在结核病实验室的诊断做了一些分析研究。
, 百拇医药
1材料
仪器与试剂:广州达安基因生物公司DA-7600荧光定量核酸扩增仪和结核分枝杆菌检测试剂盒。
2方法
2.1标本采集和处理
2.1.1标本的采集和液化
用一次性痰液收集器采集,最好留取早晨第一口痰液。痰液收集后应尽快送检。在痰液标本中加入4倍体积的4%NaOH溶液,吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。
2.1.2 1×TE溶液配制
吸取1ml20×TE,溶于19ml去离子水中,混匀即可。
2.1.3标本及质控标准品的处理
, 百拇医药
取0.5ml液化痰液至1.5ml离心管中,再加入0.5ml4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟,吸弃上清,在沉淀中加无菌生理盐水1ml打匀,15000rpm离心分钟,吸弃上清:再重复洗涤一次。(血液标本直接用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞)沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀,沸水浴10分钟(误差不超过1分钟),转至4°C静置6～8小时以保证充分裂解。1000rpm离心5分钟,取上清液2ul做核酸扩增反应。另取阴性质控品、阳性质控品各40ul加等量DNA提取液打匀,沸水浴10分钟后同上处理。
2.2加样
将样品处理上清液各2ul分别加入反应管中,混匀后置核酸扩增仪上,立即进行PCR扩增反应。
2.3核酸扩增程序
93°C→2分钟预变性,然后按95°C45秒→55°C60秒,先做10个循环,最后按93°C30秒→55°C45秒,做30个循环。
, http://www.100md.com
2.4结果分析
在定量分析中,综合考虑相关系数,误差后,设置当前域值(参考值1.2左右)。
3结果判断
Ct值无:阴性结果;Ct值<30 :阳性结果。
4质量控制
阴性质控品:全部阴性;阳性质控品(包括临界阳性质控品、强阳性质控品)全部阳性;阴性质控品Ct值>临界阳性质控标准品Ct>强阳性质控标准品Ct,则本次实验有效,否则,实验无效,应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。
5讨论
结核杆菌(TB)可以导致全身性疾病,特别是在发展中国家,其发病率较高,危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大,对抗痨药物的耐药性增加[2],从而使结核病的发病大幅度增高。虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断,但对某些病人亦可造成误诊或漏诊.分子生物学技术基本实现了简便、快速、防污染、灵敏、准确地诊断结核的目的[3],并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室[4]。应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的,且是结核杆菌的保守序列,这样才能保证检测结果的特异性[5]。自从1989年聚合酶链反应(PCR)应用于结核杆菌检测以来,该技术已广泛应用于结核病的诊断并显示出很多优点.PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围,PCR检测TB的优点主要表现如下:
, http://www.100md.com
5.1能早期诊断TB菌血症
在TB感染的早期,特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时,PCR就能给于扩增并确诊.此外,由于外周血中TB的含量甚微,又没有新的病灶形成,因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的,而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义,因为早期菌血症是较易控制的,并可以防止继发性TB病灶的形成。
5.2时间短
PCR检测TB仅需2～4h对于某些培养法难以实施的病例,PCR法则行之有效,同时提高了敏感性和特异性,可以检测到1个TB菌。
5.3有利于鉴别诊断
对于肺结核来说,其中的结核球和成人型原发性结核等,经常易于同肺癌的诊断相混淆。病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的。在这种情况下,PCR检测就显得特别有效。在许多情况下,TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等。涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点,但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值。PCR检测这类标本,可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水。另外,对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断,PCR都可以予以完成。
, 百拇医药
5.4抗痨治疗的评价
对于抗痨治疗效果的评价,以前的方法显得软弱无力。而PCR法则可以通过定期检测,采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度。 PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标。
所以分子生物学技术聚合酶链反应对于评估结核病的临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义。随着人们对结核分枝杆菌的认识不断深入,结核病临床发展的需要,我们必须从菌体水平到分子水平,从传统实验方法到现代实验方法,进行全视角全方位的研究和探索,为达到最终控制结核病提供理想手段。
参考文献
[1] 庄玉辉.加强结核病实验诊断技术的临床应用研究.中华检验医学杂志,2001,24:69-70.
[2] 勒小红、刘元东、苗 青。结核分枝杆菌耐药基因突变的研究。中华检验医学杂志,2004。27:117-117.
, http://www.100md.com
[3] Englund S.Bolske G,Ballagi-pordny A,et al,Detection of Mycobacterium avium Subsp.patatuberculosis in tissue sample by single.fluorescent and nested PCR based on theIS9100 gene.Vet Microbiol,2001,81:257-271.
[4] 夏先考、汪建国.结核杆菌PCR实验条件的优化.实用预防医学,2000,7(2):146-147.
[5] 熊汉鹏、雷建平、吴肖叶、钭方芳、刘华强、熊国亮。结核病学,江西科学技术出版社,32., http://www.100md.com(袁美琴 邬克奇)
关键词结核病;结核分枝杆菌;聚合酶链反应
20世纪90年代,全球多数发达国家结核病疫情出现明显回升,许多发展中国家出现结核病疫情严重加剧,结核病已成为全球最紧迫的公共卫生问题,目前世界上没有任何一个国家能逃脱结核病的威胁。每年全世界约有800万新发病人,约300万人因结核病而死亡。我国的情况也是如此,据2000年第四次全国结核病流行病抽样调查表明,我国结核病的形势仍然十分严峻。结核病流行病学显示高患病率、高耐药率、低递降率等特点 [1]。因此快速准确的诊断是控制结核病的主要条件,我们对使用分子生物学技术聚合酶链反应在结核病实验室的诊断做了一些分析研究。
, 百拇医药
1材料
仪器与试剂:广州达安基因生物公司DA-7600荧光定量核酸扩增仪和结核分枝杆菌检测试剂盒。
2方法
2.1标本采集和处理
2.1.1标本的采集和液化
用一次性痰液收集器采集,最好留取早晨第一口痰液。痰液收集后应尽快送检。在痰液标本中加入4倍体积的4%NaOH溶液,吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。
2.1.2 1×TE溶液配制
吸取1ml20×TE,溶于19ml去离子水中,混匀即可。
2.1.3标本及质控标准品的处理
, 百拇医药
取0.5ml液化痰液至1.5ml离心管中,再加入0.5ml4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟,吸弃上清,在沉淀中加无菌生理盐水1ml打匀,15000rpm离心分钟,吸弃上清:再重复洗涤一次。(血液标本直接用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞)沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀,沸水浴10分钟(误差不超过1分钟),转至4°C静置6～8小时以保证充分裂解。1000rpm离心5分钟,取上清液2ul做核酸扩增反应。另取阴性质控品、阳性质控品各40ul加等量DNA提取液打匀,沸水浴10分钟后同上处理。
2.2加样
将样品处理上清液各2ul分别加入反应管中,混匀后置核酸扩增仪上,立即进行PCR扩增反应。
2.3核酸扩增程序
93°C→2分钟预变性,然后按95°C45秒→55°C60秒,先做10个循环,最后按93°C30秒→55°C45秒,做30个循环。
, http://www.100md.com
2.4结果分析
在定量分析中,综合考虑相关系数,误差后,设置当前域值(参考值1.2左右)。
3结果判断
Ct值无:阴性结果;Ct值<30 :阳性结果。
4质量控制
阴性质控品:全部阴性;阳性质控品(包括临界阳性质控品、强阳性质控品)全部阳性;阴性质控品Ct值>临界阳性质控标准品Ct>强阳性质控标准品Ct,则本次实验有效,否则,实验无效,应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。
5讨论
结核杆菌(TB)可以导致全身性疾病,特别是在发展中国家,其发病率较高,危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大,对抗痨药物的耐药性增加[2],从而使结核病的发病大幅度增高。虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断,但对某些病人亦可造成误诊或漏诊.分子生物学技术基本实现了简便、快速、防污染、灵敏、准确地诊断结核的目的[3],并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室[4]。应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的,且是结核杆菌的保守序列,这样才能保证检测结果的特异性[5]。自从1989年聚合酶链反应(PCR)应用于结核杆菌检测以来,该技术已广泛应用于结核病的诊断并显示出很多优点.PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围,PCR检测TB的优点主要表现如下:
, http://www.100md.com
5.1能早期诊断TB菌血症
在TB感染的早期,特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时,PCR就能给于扩增并确诊.此外,由于外周血中TB的含量甚微,又没有新的病灶形成,因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的,而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义,因为早期菌血症是较易控制的,并可以防止继发性TB病灶的形成。
5.2时间短
PCR检测TB仅需2～4h对于某些培养法难以实施的病例,PCR法则行之有效,同时提高了敏感性和特异性,可以检测到1个TB菌。
5.3有利于鉴别诊断
对于肺结核来说,其中的结核球和成人型原发性结核等,经常易于同肺癌的诊断相混淆。病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的。在这种情况下,PCR检测就显得特别有效。在许多情况下,TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等。涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点,但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值。PCR检测这类标本,可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水。另外,对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断,PCR都可以予以完成。
, 百拇医药
5.4抗痨治疗的评价
对于抗痨治疗效果的评价,以前的方法显得软弱无力。而PCR法则可以通过定期检测,采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度。 PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标。
所以分子生物学技术聚合酶链反应对于评估结核病的临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义。随着人们对结核分枝杆菌的认识不断深入,结核病临床发展的需要,我们必须从菌体水平到分子水平,从传统实验方法到现代实验方法,进行全视角全方位的研究和探索,为达到最终控制结核病提供理想手段。
参考文献
[1] 庄玉辉.加强结核病实验诊断技术的临床应用研究.中华检验医学杂志,2001,24:69-70.
[2] 勒小红、刘元东、苗 青。结核分枝杆菌耐药基因突变的研究。中华检验医学杂志,2004。27:117-117.
, http://www.100md.com
[3] Englund S.Bolske G,Ballagi-pordny A,et al,Detection of Mycobacterium avium Subsp.patatuberculosis in tissue sample by single.fluorescent and nested PCR based on theIS9100 gene.Vet Microbiol,2001,81:257-271.
[4] 夏先考、汪建国.结核杆菌PCR实验条件的优化.实用预防医学,2000,7(2):146-147.
[5] 熊汉鹏、雷建平、吴肖叶、钭方芳、刘华强、熊国亮。结核病学,江西科学技术出版社,32., http://www.100md.com(袁美琴 邬克奇)