炎症状态下大鼠腰椎小关节感觉神经的多元支配模式
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摘要目的：研究大鼠腰椎小关节在炎症状态下的神经支配模式的多元性及其传导机制。方法：通过逆行神经追踪法，将荧光金注入大鼠左侧L5/6小关节内。5天后，分别将50μl生理盐水或弗氏佐剂注入对照组或实验组。第一次术后12天，麻醉后经心脏用0.9%的盐水，紧跟着500ml 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1M, PH 7.4)灌注。取双侧T13-L6水平的DRGs，冰冻切片后分组行SP和IB4免疫组化，最后用荧光显微镜观察计数F-G标记神经元与SP和IB4阳性神经元，并测量每个神经元的横截面积。结果：支配大鼠L5/6小关节的神经元分布于同侧的L1-L5 DRGs。在所有F-G标记的神经元中，实验组SP阳性神经元的比例为36%±3%(Mean±S.E.)明显高于对照组的21%±2%(P<0.01)，前者SP阳性神经元的横截面积为900.1±34.8μm2，也明显大于对照组的738.8±30.2μm2(P<0.01)。两组中均未发现IB4阳性神经元。无论是实验组还是对照组，L3-L5 DRG中SP阳性神经元的比例均高于L1和L2中的比例。结论：大鼠L5/6小关节是由以NGF依赖性神经元为主的同侧L1-L5DRG神经元多节段支配的。炎症可使与大鼠L5\6小关节相应的DRG中SP阳性NGF依赖性神经元数目增加，横截面积增大，这可能是小关节炎症通过NGF依赖性神经元传导机制的一种表达，理论上抗NGF治疗对于由炎症介导的下腰痛应具有良好的镇痛作用。
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关键词下腰痛；小关节；炎症；背根节；P物质；IB4；神经生长因子；神经胶质细胞源性神经营养因子
下腰痛十分常见，由于其原因和发生机制十分复杂，因此临床上诊治仍十分困难。腰椎小关节病变是导致下腰痛的主要原因之一1, 2, 3。传统的理论认为腰骶椎的结构包括小关节是由节段性分布的脊神经背支的内侧分支支配4。但这种节段性的神经支配模式并不能解释临床上常见的因下腰椎小关节病变导致的髋关节前方的牵涉痛。因此阐明腰椎小关节源性下腰痛的神经支配与传导模式十分必要。
本实验采用逆行神经追踪和免疫组化方法研究大鼠L5/6小关节在生理和炎症状态下神经支配途径和对应背根神经节内不同神经元的表达，从而在分子生物学角度探讨腰椎小关节的神经支配模式以及小关节源性下腰痛可能的产生机制。
1材料和方法
取重约250-300g的SD大鼠(由浙江省医学科学院提供)，分对照组和实验组，各16只。腹腔内注射硫喷妥钠(30mg/kg)麻醉，在无菌原则下，显露左侧L5/6小关节，将一枚针尖上填有荧光金(Fluoro-gold, F-G； Fluorochrome, Biotium，Hayward，CA, USA)晶体的24号留置针刺进L5/6小关节，针眼用氰基丙烯酸盐粘合剂封闭，缝合筋膜和皮肤。术后5天将50μl 弗氏佐剂(Mycobacterium butyricum in a saline-in-oil emulsion； Sigma, St. Louis, MO) 注射到实验组大鼠的同个小关节中，对照组则注射50μl生理盐水。第一次术后12天再次麻醉后，经心脏先用生理盐水，紧接500ml 4% 的多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1M, PH 7.4)灌注，最后取大鼠双侧T13-L6的背根节(Dorsal root ganglion, DRG)。
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标本在4°C恒温下泡入同种固定液中过夜，然后置于4°C含20%蔗糖的0.01M的磷酸缓冲盐水(PBS)20小时，再连续切片，片厚20μm，予以全部收集于载玻片上。在室温下用抗体稀释液(含0.3%Triton X-100和1% 牛血清白蛋白的0.01M PBS)处理90分钟。每组各取8只大鼠的DRGs分别进行P物质(substance P, SP)和 IB4(isolectin B4, IB4)的免疫组化，在4°C下用抗体稀释液稀释的兔抗SP的多克隆抗体(1:100，Biomeda，Foster City，CA)及IB4(12.5μg/ml biotinylated IB4; Sigma, St. Louis, MO) 反应20小时。接着用Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG(对SP；1:400；Molecular Probes Inc, Eugene, OR)及Alexa Fluor 488 conjugate of streptavidin(对IB4；1:400； Molecular Probes Inc, Eugene, OR)培养2小时。每一步结束后，切片都用0.01M PBS漂洗3次。
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最后，采用荧光显微镜以看到细胞核为准，分别对所有F-G标记的神经元以及F-G标记的SP-ir或IB4结合的神经元进行计数，并用ImageTool(UTHSCSA ImageTool for windows, version 3.0)通过测量每个神经元的的灰度计算其横截面积。
用非对照Welch’s t-test (GraphPad QuickCalcs, GraphPad software Inc. San Diego, CA)进行统计学分析，P<0.05有统计意义。
2结果
本实验所有32只大鼠的双侧T13-L6共448个背根节中，仅在同侧L1到L5的DRG中发现F-G标记的神经元，而对侧所有的DRG以及同侧的T13和L6 DRG中未发现F-G标记的神经元。
图1. 显示FG标记(A，C，E，F)，SP阳性(B)，以及IB4结合神经元(D)。其中A和B箭头所示为L4DRG中的同一神经元细胞，即FG标记SP阳性阳性神经元。C和D箭头所示为L3DRG中的同一神经元，FG标记IB4阴性神经元。E箭头所示为大直径神经元，其横截面积为1464.9μm2；F箭头所示为小直径神经元，其横截面积为548.4μm2。标尺=50μm.
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Fig1.Fluorescent photomicrographs show the F-G-labeled (A, C), SP-ir (B) or IB4-binding (D) neurons. (B)
2.1对照组
在行SP免疫组化的8只大鼠中，我们总共发现321个F-G标记的神经元，而SP阳性神经元在各DRG中的数目分别为L1：5，L2：9，L3：21，L4：20，L5：13，L1及L2背根节SP阳性神经元的数目明显少于L3、L4和L5中的，两者差别有高度显著性意义，P<0.001(图2)。行IB4免疫组化的8只大鼠中有294个F-G标记的神经元，但未发现一个IB4结合神经元(图1)。
2.2实验组
在行SP免疫组化的8只大鼠中，总共发现310个F-G标记的神经元，其中SP阳性神经元的数目分别为L1：10，L2：12，L3：31，L4：32，L5：26，在L1及L2背根节中的数目明显小于L3、L4和L5中的，两者差别有高度显著性意义，P<0.001(图1、2)。行IB4免疫组化的8只大鼠共发现312个F-G标记的神经元，但无一个IB4结合神经元(图1)。, 百拇医药(周 健 沈立锋 范顺武 方向前)