姜黄煎对大鼠血管损伤后血清中NADPH氧化酶与NF-KB表达的影响意义
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【摘要】 目的:探讨大鼠血管急性损伤后血清中转录因子-κB (NF -κB)和NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)的水平及姜黄煎对其影响意义。方法:模拟血管内膜损伤模型,并采用ELISA法，检测144只大鼠血清中NADPH与NF - κB水平。其中姜黄煎干预组36只,生理盐水干预组36只,并与36只假手术组和36只健康组作为对照。结果: 模拟血管急性损伤后血清NADPH与NF-κB水平含量明显增高，用药3天姜黄煎组血清NADPH及NF-κB出现下降趋势; 用药7天组姜黄煎组血清NADPH及NF-κB表达显著下降 ( P < 0. 05)，用药14天组与生理盐水组比较血清NADPH上升，NF-κB仍维持低水平表达(P < 0. 05)。结论: NF -κB与NADPH可能参与了血管内膜损伤后再狭窄的病生理变化。Tuiduan检测患者血清NF-κB与NADPH水平含量可能有助于评估血管损伤后再狭窄病变的程度及转归。姜黄煎对大鼠NF -κB与NADPH水平具有具有一定的调控作用。
【关键词】 姜黄煎； 核转录因子-κB；NADPH氧化酶
经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病最有效的方法之一。但微创导致氧化应激在内膜损伤的发展过程中起到作用是不容忽略的。其中NADPH氧化酶与NF -κB的参与炎性反应也是起到非常重要的作用。本研究模拟内膜损伤的大鼠模型，检测大鼠血清中NADPH氧化酶及NF -κB的表达，比较中药姜黄煎对其的影响报道如下：
1材料与方法
1.1实验动物
实验动物为成年雄性封闭群纯种Swiswebster大鼠144 只,每只为270g，来源于北京医学动物中心,动物合格证号:医动证字 200602。
1.2实验方法
将实验动物随机分成4组,每组36只。自然条件下饲养。正常对照组未给任何处理。假手术组(36只)开腹后缝合未下导管;模型组( 36只)与姜黄煎组(36只)模拟血管内膜损伤术,采用SwisWebster雄性大鼠(270 ±10) kg作为造模对象。水合氯醛0.6mL腹腔注射,充分麻醉后固定四肢,从大鼠的股动脉左侧或右侧的股动脉均可施行手术。大鼠大腿内侧酒精消毒剃毛后,用手术剪切开皮肤,首先钝性分离股动脉和周围组织,小心地分开伴随股动脉的周围神经,以6号手术丝线将分离的股动脉两端轻轻拉开,随后分离股动脉在股直肌和股内侧肌之间的小分枝,在分枝的远端用6号丝线结扎,近端用手术丝线拉开后,用显微外科手术镊子将该处的静脉和周围组织从动脉周围分离。在暴露的动脉血管枝处,用微型手术剪在分枝处做一横向切口,从切口向腹股沟方向,将长度为2mm直径为0. 138mm的导丝的导丝插入,深度达股动脉内5mm,至髂动脉处。导丝插入到适当位置后停留1min,来回重复3 次,以造成内膜剥离和动脉血管扩张,随后取出导丝,结扎股直肌和股内侧肌之间的股动脉分枝的近端,松开髂部动脉上的丝线,恢复血流。用6号丝线缝合皮肤手术器械和敷料应严格消毒,整个手术应在无菌操作台上施行,腹腔注射青霉素10 万U。术后24h内正常普通饲料喂养。
治疗组在造模24h后开始每天予姜黄煎(100mg/kg)灌胃,模型组给予生理盐水均连续14天。分别于3天、7天和14天处死,全部实验动物在预定时间处死前从腹腔静脉采集血标本进行分离血清待测定。
1.3标本的采集
分离及保存从实验大鼠腹腔静脉采集空腹血5mL,置于清洁血清分离管中,室温下自然凝固后离心(4000rpm) 10min,收集血清分装后置- 80℃冰箱保存。测定前2h放置于室温环境自然解冻。
1.4测定方法
采用ELISA方法测定血清NF -κB与NADPH水平含量。ELISA试剂盒由尚柏生物医学技术(北京)有限公司提供。利用DNX - 9620电脑洗板机及MetertechΣ960型酶标仪测定。试剂盒标准曲线相关系数均在0. 99以上。试剂盒应平衡至室温(20~25℃ )再试验。取出所需反应板。临用前15分钟配制工作液。
1.5统计学方法
统计学处理所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
各组大鼠分别在术后3天，7天，14天测定血清中NADPH氧化酶与NF -κB含量测定结果见表1~3。
3讨论
PCI术后血管内膜的损伤是导致在狭窄主要原因之一。而血管内膜损伤后 NADPH氧化酶激活后可以产生活性氧，而活性氧则作为第二信使能够激活NF-κB等多种细胞内信号传导途径，从而参与炎症反应、细胞增殖及新生内膜的形成，参与再狭窄的病变过程。许多的基础与临床研究中证实了这一生物学特性。
NADPH氧化酶是血管系统中和中性粒细胞内生成活性氧(ROS)的主要酶体，它最早在吞噬型细胞(中性粒细胞细胞、单核巨噬细胞)中被发现[1]。球囊损伤后造成急性的血管内膜损伤，血管内膜由平滑肌细胞和浸润的炎症细胞表达NADPH氧化酶，产生大量活性氧，激活细胞信号传导途径，使血管平滑肌细胞迁移、增殖，导致内膜增生。
NF-κB广泛存在于淋巴细胞和非淋巴细胞中，当细胞受到病毒感染、细胞因子、PMA、DNA损害剂、辐射、活性氧等多种因素刺激后，NF-κB被活化并与相应的病毒、炎症细胞因子、黏附分子、受体等所调节的基因增强子区相结合，从而启动基因的转录[2]。
研究证实,PCI术后，NADPH氧化酶使血管平滑肌细胞活性氧生成增加，活性氧成分增多后，使Ras或Raf-1活化，Raf-1可以促进NF-κB/IκB复合物的磷酸化，活化的NF-кB进入细胞核，启动靶基因转录，发挥生物学效应[3]。
中医学认为“再狭窄”临床表现属于祖国医学中的“胸痹心痛”的大致范畴, 病机为本虚标实，气阴两虚,血行不畅,心脉闭阻。因此应以“益气养阴、活血通络”论治，通过加强自身免疫来调控内皮功能的稳态平衡，起到抑制炎性因子释放和稳定斑块的作用。中药姜黄味辛、苦，温，具有破血行气，通经止痛之功效。近来药理学研究发现，姜黄具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、清除超氧负离子、硝酸氧自由基等广泛的医学价值[4、5]。本研究观察姜黄煎对模拟血管内膜损伤术后再狭窄模型的影响,检测血清中的NADPH氧化酶与NF -κB活性表达的变化, 结果显示姜黄可抑制NADPH氧化酶，下调NF -κB的含量水平，用药3天姜黄煎组血清NADPH及NF -κB出现下降趋势; 用药7天组姜黄煎组血清NADPH及NF -κB表达显著下降 ( P < 0. 05)，用药14天组与生理盐水组比较血清NADPH上升，NF -κB仍维持低水平表达(P < 0. 05)。证明用药早期姜黄可能通过抑制NADPH活性,明显降低NF–κB水平，减少了NF-κB/IκB复合物的磷酸化，从而实现保护血管内膜，抑制血管平滑肌增殖及新生内膜形成。总之，血管内膜损伤术后 ......
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