浅析原发性肝癌患者前X基因的分子流行病学意义
【摘要】目的：了解前X基因在HBV相关HCC患者中的流行病学分布、前X基因和HBV基因型与HCC的临床关系. 方法： 患有乙肝的肝细胞肝癌患者(HCC)35例，采用型特异性引物巢式聚合酶链反应进行基因分型.结果： HCC患者35例中B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例，未定型者2例. 明确基因型的患者33例，进一步扩增前 结论： HCC患者中C基因型、B/C混合基因型较为多见. 前X多肽在HCC患者中有较高的编码率，前X区多肽可能和HCC之间有一定相关性.
【关键词】肝炎病毒；乙型 基因型前；X基因；癌肝细胞
【Abstract】Objective: To understand the former X gene in HCC patients with HBV-related epidemiological distribution, before the X gene and HBV genotype and clinical HCC. Methods: People with hepatitis B patients with hepatocellular carcinoma (HCC) 35 例using type-specific primers nested polymerase chain reaction genotyping. Results: HCC in 35 patients with genotype 1 case B, C genotype of 24 patients, B / C mixed genotype in 8 cases, 2 cases were not finalized. 33 patients with genotype specific, and further amplified before the conclusion: HCC patients with genotype C, B / C mixed genotype is more prevalent. pre X peptides in HCC patients have a higher encoding rate, the former XDistrict peptides may be some correlation between HCC.
【Key words】Hepatitis B virus genotype pre X gene hepatocellular carcinoma
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)在其负链上含4个部分重叠的开放读码框架(open reading frame, ORF)即前S/S区、前C/C区、P区和X区，分别编码7种性质不同的蛋白如HBcAg，HBeAg，HBsAg等. 有研究表明，X 区编码的HBxAg与肝细胞肝癌(HCC)的形成密切相关。 研究证实，在X ORF的上游还存在一个新的ORF即前X ORF，而关于其的功能研究尚不多见，是否具有类似功能尚不确定，我们对前X ORF功能进行初步探讨.
1对象和方法
1.1对象200401/200412 HBV DNA阳性的HCC患者35例. 所有患者均经B超、CT和核磁共振(MRI)或血管造影等临床诊断为乙肝相关性肝癌，采用蛋白酶K、酚氯仿异戊醇法提取血清HBV DNA. 乙肝标志物的测定均采用ELISA法检测，试剂由华美生物工程有限公司提供. 生化指标(ALT)由我院全自动生化检测仪常规测定.
1.2方法通过比对不同HBV基因型序列以及参考Natio等设计的6种主要基因型的分析方法，设计了共同的外引物P1, P2，进行PCR扩增，并以扩增产物为模板进行基因型特异性内引物扩增. 基因型特异性内引物扩增分为A，B两组，其中A组包括共有的上游引物P3, PA(基因型A特异性下游引物), PB(基因型B特异性下游引物)，PC(基因型C特异性下游引物)，B组包括上游引物P4以及基因型D, E, F的特异性下游引物PD, PE, PF，同时行PCR扩增. 取第2轮PCR扩增产物5 μL经过20 g/L琼脂糖凝胶电泳后判断HBV基因型，根据电泳结果判断HBV基因型.
以35例HCC患者中明确HBV基因分型的33例患者HBV DNA溶液为模板，根据前X上游引物Px1,下游引物为Px2，扩增前X区. Px1下游第3133 nt处为前X区起始密码子ATG，Px2上游3032 nt处为X区起始密码子ATG，扩增的靶区域全长231 nt，其中前X区全长为168nt. 将PCR产物回收并连接至PMD 18T载体，将连接好的重组体转入感受态细胞，经氨苄青霉素(Amp)和Xgal蓝白斑法初步筛选阳性菌落，进一步提取质粒采用PCR法鉴定. 对经过鉴定的成功导入前X基因的菌落送测序.
统计学处理：所有数据应用SPSS13.0统计软件分析，不同组间率的比较采用χ2检验，均数比较采用t检验. P<0.05表示有统计学意义.
2结果
2.1HBV基因型应用该基因型分型方法，A组PCR产物电泳时A基因型为68 bp，B基因型为281 bp，C基因型为122 bp;B组电泳时D基因型为119 bp，E基因型为167 bp，F基因型为67 bp. 本组的35例患者中，B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例，未定型者2例，未见其他基因型.
2.2前X基因PCR扩增扩增的靶区域全长231 bp，成功构建出PMD18T前X载体后，以PMD18T载体上游引物M13和Px1为上游引物、Px2为共有的下游引物同时行PCR扩增，可得到308 bp和231 bp的片断，说明克隆成功., 百拇医药(汪波)
【关键词】肝炎病毒；乙型 基因型前；X基因；癌肝细胞
【Abstract】Objective: To understand the former X gene in HCC patients with HBV-related epidemiological distribution, before the X gene and HBV genotype and clinical HCC. Methods: People with hepatitis B patients with hepatocellular carcinoma (HCC) 35 例using type-specific primers nested polymerase chain reaction genotyping. Results: HCC in 35 patients with genotype 1 case B, C genotype of 24 patients, B / C mixed genotype in 8 cases, 2 cases were not finalized. 33 patients with genotype specific, and further amplified before the conclusion: HCC patients with genotype C, B / C mixed genotype is more prevalent. pre X peptides in HCC patients have a higher encoding rate, the former XDistrict peptides may be some correlation between HCC.
【Key words】Hepatitis B virus genotype pre X gene hepatocellular carcinoma
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)在其负链上含4个部分重叠的开放读码框架(open reading frame, ORF)即前S/S区、前C/C区、P区和X区，分别编码7种性质不同的蛋白如HBcAg，HBeAg，HBsAg等. 有研究表明，X 区编码的HBxAg与肝细胞肝癌(HCC)的形成密切相关。 研究证实，在X ORF的上游还存在一个新的ORF即前X ORF，而关于其的功能研究尚不多见，是否具有类似功能尚不确定，我们对前X ORF功能进行初步探讨.
1对象和方法
1.1对象200401/200412 HBV DNA阳性的HCC患者35例. 所有患者均经B超、CT和核磁共振(MRI)或血管造影等临床诊断为乙肝相关性肝癌，采用蛋白酶K、酚氯仿异戊醇法提取血清HBV DNA. 乙肝标志物的测定均采用ELISA法检测，试剂由华美生物工程有限公司提供. 生化指标(ALT)由我院全自动生化检测仪常规测定.
1.2方法通过比对不同HBV基因型序列以及参考Natio等设计的6种主要基因型的分析方法，设计了共同的外引物P1, P2，进行PCR扩增，并以扩增产物为模板进行基因型特异性内引物扩增. 基因型特异性内引物扩增分为A，B两组，其中A组包括共有的上游引物P3, PA(基因型A特异性下游引物), PB(基因型B特异性下游引物)，PC(基因型C特异性下游引物)，B组包括上游引物P4以及基因型D, E, F的特异性下游引物PD, PE, PF，同时行PCR扩增. 取第2轮PCR扩增产物5 μL经过20 g/L琼脂糖凝胶电泳后判断HBV基因型，根据电泳结果判断HBV基因型.
以35例HCC患者中明确HBV基因分型的33例患者HBV DNA溶液为模板，根据前X上游引物Px1,下游引物为Px2，扩增前X区. Px1下游第3133 nt处为前X区起始密码子ATG，Px2上游3032 nt处为X区起始密码子ATG，扩增的靶区域全长231 nt，其中前X区全长为168nt. 将PCR产物回收并连接至PMD 18T载体，将连接好的重组体转入感受态细胞，经氨苄青霉素(Amp)和Xgal蓝白斑法初步筛选阳性菌落，进一步提取质粒采用PCR法鉴定. 对经过鉴定的成功导入前X基因的菌落送测序.
统计学处理：所有数据应用SPSS13.0统计软件分析，不同组间率的比较采用χ2检验，均数比较采用t检验. P<0.05表示有统计学意义.
2结果
2.1HBV基因型应用该基因型分型方法，A组PCR产物电泳时A基因型为68 bp，B基因型为281 bp，C基因型为122 bp;B组电泳时D基因型为119 bp，E基因型为167 bp，F基因型为67 bp. 本组的35例患者中，B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例，未定型者2例，未见其他基因型.
2.2前X基因PCR扩增扩增的靶区域全长231 bp，成功构建出PMD18T前X载体后，以PMD18T载体上游引物M13和Px1为上游引物、Px2为共有的下游引物同时行PCR扩增，可得到308 bp和231 bp的片断，说明克隆成功., 百拇医药(汪波)