制备壳聚糖纳米粒的影响因素考察
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【摘要】本文主要以粒径为壳聚糖纳米粒的评价指标，通过对乳化交联法和离子凝聚法(Sodium Polyphosphate做交联剂)制备壳聚糖纳米粒的影响因素考察，确定摩尔分子量是影响制备壳聚糖纳米粒的关键因素.对于乳化交联法，分别考察了机械搅拌法和高压均质法这两种乳化的方法的各种影响因素。对于离子凝聚法，考察的影响因素包括加入顺序、不同规格壳聚糖、药物曲尼司特、多聚磷酸钠的浓度和用量等。结果证明乳化交联法只能制备出微米级的粒子，而离子交联法只能制备出粒子浓度特别低的纳米粒溶液。
【关键词】壳聚糖，纳米粒，曲尼司特，离子交联法
1仪器与材料
1.1实验仪器
高压均质机Emulsiflex—CSAvestin
微米粒度仪 Zetasizer Malvern instrument Ltd.
BS110S型电子天平 北京赛多利斯天平公司
KQ-250超声仪 中国江苏昆山超声仪
纳米粒子测定仪 Zetasizer 3000HSaMalvern
1.2实验试剂及药品
戊二醛溶液(25%) 国药集团化学试剂有限公司
多聚磷酸钠(Polyphosphate Sodium，TPP)国药集团化学试剂有限公司
多种规格壳聚糖 Zhejiang Aoxing Biotechnology
曲尼司特原料药 中国药科大学制药厂
2实验方法和结果
本实验制备壳聚糖纳米粒主要采用了两种方法，一是乳化交联法[1]，另一个是离子凝聚法[2]。乳化交联法中影响壳聚糖纳米粒的主要因素有：乳化方法，搅拌方法，交联时间，交联剂的用量，壳聚糖的用量等。离子凝聚法制备壳聚糖纳米粒得主要影响因素有：壳聚糖的分子量，壳聚糖的浓度和用量，药物的浓度和用量，交联剂的浓度和用量等。
2.1乳化交联法中搅拌方式对制备壳聚糖纳米粒的影响[3]将100ml 浓度为2.5%(W/V)的壳聚糖(分子量330万)，加入20ml2.78mg/ml的曲尼司特药物溶液(溶剂为乙醇：丙酮=1：1)，再加入20ml液体石蜡，加入数滴吐温80，用高压均质机300Bar乳匀后，得到120ml的乳剂。取4份22毫升的乳液分别用20毫升水稀释，加入15.7毫升的戊二醛溶液，分别用200、600、1400转/分的机械搅拌和磁力搅拌2小时。用微米粒度仪测定粒径结果见表1。
Tab.1 The effect of different stirring methods on nanoparticle size
由表中可以看出，随着机械搅拌速度的增加粒径变大。而相同条件下采用磁力搅拌处理得到的微球的粒径分布范围变窄，大小相差不大。所以此后胶联时主要采用磁力搅拌进行处理。
2.2交联剂用量、交联时间、温度和初乳的浓度对制备壳聚糖纳米粒的影响
2.2.1高压均质法制备初乳[4]将125ml 浓度为2.5%(W/V)的壳聚糖(黏均分子量330万)，加入20ml2.78mg/ml的曲尼司特的药物溶液(溶剂为乙醇：丙酮=1：1)，再加入20ml液体石蜡，加入数滴吐温80，用高压均质机600Bar乳匀后，得到115ml的初乳。
2.2.2交联法制备微(纳)米球每次取12ml上述初乳，按照下表进行处理。即将初乳稀释，加水至C倍原体积，在温度D水浴条件下，磁力搅拌下滴加体积为B的交联剂戊二醛溶液(25%)，继续搅拌A小时，之后用石油醚萃取三次，得到壳聚糖微球的混悬液，用马尔文微米粒度仪测定大小分布。结果见表2。A是交联时间，分为1、2、3小时三个水平；B是交联剂用量，是对初乳中所含2.5%壳聚糖溶液的体积的倍数，分为0.5、1.0、1.5倍三个水平；C是初乳稀释的倍数，分为4、6、8倍三个水平；D是水浴温度，分为30、40、50℃三个水平。
Tab.2Investigation of different influential factors in preparing nanoparticles by orthogonal test (L934)
从结果看出，第七和九个实验得到粒径分布范围比较集中，虽然制备的粒子没有达到纳米级别,但此后在进行对初乳进行交联处理时仍主要采用这两个方式。
2.3乳化交联法中压力对制备壳聚糖纳米粒的影响采用2因素2水平的星点复合设计考察高压均质时压力和壳聚糖用量两个因素对制备初乳的影响，压力(A)，两水平300和800bar，壳聚糖体积(B)两水平40和120ml，考察对制备壳聚糖纳米粒的影响。固定液体石蜡的量20ml，取制备的初乳16ml，用表2中的第七种方法实验，结果见表3.
Tab.3Investigation the influences of pressure and chitosan amount in preparing nanoparticles by center design
用设计软件Design Expert6.0.10分析，最后得到结果如下：以水平代码表示的方程Response=+1.77+0.29* A-0.64* B，从结果可以看出，制备的粒子主要是微米级别，而且变化都是在同一数量级内发生，所以压力对用高压均质法制备壳聚糖纳米粒粒径影响不大。
2.4离子凝聚法中壳聚糖分子量、浓度和交联剂的用量对制备空白壳聚糖纳米粒的影响
离子凝聚法制备空白壳聚糖纳米粒的基本方法：配制浓度为1.0mg/ml和2.0mg/ml的壳聚糖溶液25ml，室温磁力搅拌下分别用恒流泵加入2.0、4.0、6.0ml 的1.0 mg/ml多聚磷酸钠溶液(Sodium Polyphosphate，TPP)，加入速度为1ml/min，搅拌30分钟后停止搅拌，静置20min，用双层纱布和G-1漏斗过滤后，用纳米粒度仪测定。记录每一种壳聚糖粒子的最小粒径，结果见表4和图3。从结果看出，纳米粒分散指数较大，粒径在261nm以上。
Tab.4 The influences of chitosan(CS) molecular weight and sodium polyphosphate(TPP) amounts in preparingnanoparticles
Fig.3Particle size of blank nanoparticles prepared with different molecular weight chitosan：(A)MW=594，000, (B)MW=875，000，(C)MW=906，000(D)MW=330，000，(E)MW=400，000
2.5离子凝聚法载药壳聚糖纳米粒的制备将分子量分别为59.4万、87.5万、90.6万、330万和400万的壳聚糖溶解成0.5、1.0、2.0mg/ml的溶液，室温磁力搅拌下，加入药物溶液或药物与TTP的混合液，加入后即见到肉眼可见蓝色悬浮物，搅拌一定时间后，用0.8um滤膜过滤，滤液中几乎得不到纳米粒 ......
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