一种产纤溶酶真菌培养条件的优化
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【摘要】目的：确定一种产纤溶酶的植物内生真菌的培养基组成，使纤溶酶的产量得到较大提高。方法和结果：采用单因素试验结合正交试验确定培养基组分为蔗糖20 g/L、玉米粉35 g/L、黄豆饼粉35 g/L、MgSO4 32 μmol/L、KH2PO4 8 μmol/L、CaCO3 4000 μmol/L、ZnSO4 0.04 μmol/L、FeSO4 0.04 μmol/L、MnSO4 0.04 μmol/L。结论：本试验在较短时间、较低试验次数的情况下优化了产纤溶酶的真菌的培养条件，为进一步研究该酶的药理、药效学性质打下了基础。
【关键词】纤溶酶；真菌培养基；凝血酶时间
抗血栓药物中，纤溶酶是很重要的一类。在自然界中，动物、植物、微生物中都发现了天然的溶栓活性物质。动物来源的纤溶酶，目前研究比较多的是从蚯蚓、蛇毒和吸血蝙蝠的唾液中提取的纤溶酶；植物来源的纤溶酶主要是从蒲黄中提取的[1]。微生物产生多种纤溶酶，如链激酶、葡激酶、枯草激酶等[2,3,4]。本文以一株产生具有纤溶活性物质的植物内生真菌为对象，初步建立了该菌的培养条件。
1材料与方法
1.1仪器、试剂、材料及动物
低速离心机；恒温水浴锅；枸橼酸钠(分析纯)、培养基成分均为市售；凝血酶(上海鹰跃生物试剂有限公司)；家兔；纤溶酶产生菌。
1.2凝血酶时间(TT)测定方法[5]
家兔颈动脉取血4 mL，置于预先装有3.8%枸椽酸钠0.5 mL的试管中混匀， 离心10 min(3000 r/min)，收集血浆混匀，2～8℃保存备用。发酵液上清适度稀释，取0.2 mL抗凝血浆和0.2 mL稀释发酵液(对照组用生理盐水)置试管内混匀，于37℃孵育3 min，加入37℃预温的4 u/mL凝血酶溶液0.4 mL，快速混匀，测定凝血酶时间。
1.3正交试验设计
1.3.1碳氮源浓度的考察选用L9(3)4表进行设计，因素和水平。
1.3.2培养条件：试验采用500ml三角瓶，每瓶装量25ml，28℃培养六天。
2结果
首先利用单因素试验对培养基进行了考察。单因素试验是考察一种因素时，其他因素固定不变，只变动该因素。
2.1碳源的考察：通常微生物培养基中既有速效碳源，又有迟效碳源，这样既能保证培养初期菌体的快速生长，又有利于菌体产生较多的产物。考察了十一种碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、果糖、糊精、可溶性淀粉、小麦淀粉、面粉、玉米淀粉、玉米粉。结果速效碳源中蔗糖产生纤溶酶时活性最高，因此选用蔗糖作为速效碳源；玉米粉作为迟效碳源时产生纤溶酶活性最高，因此采用玉米粉为迟效碳源。
2.2氮源的考察分别考察了硫酸铵，牛肉膏，黄豆饼粉，酵母粉。结果以黄豆饼粉作为氮源时酶活性最高，所以氮源采用黄豆饼粉。
2.3无机离子种类与浓度的考察无机离子主要作为酶的辅因子、酶的激活剂或抑制剂，同时还能维持渗透压，调节pH值。通过对六种无机离子因素的考察，试验结果如表1所示。
根据单因素实验结果，确定对蔗糖、玉米粉和黄豆饼粉这三个因素通过正交试验进行进一步考察，从而确定这三种物质的最适浓度。
通过方差分析可知蔗糖、玉米粉和黄豆饼粉这三因素对纤溶酶的产生均有显著影响。通过直观分析，最优组合为蔗糖、玉米粉和黄豆饼粉浓度分别为20，35，35 g/L时发酵所得纤溶酶活性最高。从而确定了一种纤溶酶产生菌的适宜培养基组成：蔗糖20 g/L、玉米粉35 g/L、黄豆饼粉35 g/L、MgSO4 32 μmol/L、KH2PO4 8 μmol/L、CaCO3 4000 μmol/L、ZnSO4 0.04 μmol/L、FeSO4 0.04 μmol/L、MnSO4 0.04 μmol/L。
3讨论
通过单因素试验，可以方便的确定培养基的组成。正交试验可以在较少的试验次数下对多种因素的多种水平进行考察，不仅大大减少了试验次数，而且并不会降低试验数据的准确性。本实验通过单因素试验结合正交试验在较短时间、较低试验次数的情况下确定了产纤溶酶的真菌的培养基组成，使纤溶酶的产量得到很大提高，为近一步研究该酶的药理、药效学性质打下了基础。
参考文献
[1]赵洪.何执中.溶栓药物研究进展[J] ......
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